梅毒的免疫学实验诊断进展

陈锐, 郑雅雯, 陈红, 林丽蓉

厦门大学附属中山医院临床检验中心 厦门大学医学院传染病研究所， 福建 厦门 361004

梅毒(syphilis)是一种性传播疾病，在《中华人民共和国传染病防治法》中被列为乙类防治病种，其病原体为梅毒螺旋体(Treponemapallidum，Tp)，属苍白密螺旋体苍白亚种。近年来，梅毒的全球发病率和流行范围不断增加[1-2]。由于存在隐性感染和难以统计的私人诊所接诊患者，其真实发病率或远高于目前所公布数据[3]。梅毒临床表现复杂，其诊断在很大程度上依赖于实验室检查结果。实验室检查包括形态学检查、分子生物学检查和免疫学检查。形态学检测易受取材部位、取材方法等因素影响，灵敏度较低[4]，而分子生物学检测Tp DNA对于一期或二期梅毒患者皮损有较高的灵敏度和特异性[4]，但对于较易获得的血液样本DNA检测率低[5]，且国内尚无已获得医疗器械注册证的检测试剂。免疫学检查是诊断梅毒的主要实验室检查方法[6-7]。本文就传统免疫学实验诊断在梅毒中的应用及新免疫指标的进展作一综述，重点阐述梅毒血清学试验、梅毒细胞免疫学试验和梅毒螺旋体抗原试验进展，旨在为各级实验室结合自身条件及临床需求选择合适的梅毒免疫学检测方法提供依据。

1 梅毒血清学试验

鉴于形态学检查和分子生物学检查的局限性，采用血清学试验检测抗体仍是实验室检测梅毒感染最常用的方法，包括梅毒非特异性抗体试验和梅毒特异性抗体试验。前者采用心磷脂-卵磷脂-胆固醇复合物抗原，检测抗心磷脂的非特异性抗体；后者采用天然或重组的梅毒螺旋体抗原，检测抗梅毒螺旋体成分的特异性抗体。

1.1 梅毒非特异性抗体试验

此类试验是基于Tp感染后宿主细胞释放的类脂质和Tp表面脂质产生的非特异性抗体，即反应素[8]。目前国内外常用的梅毒非特异性抗体检测方法包括性病研究实验室试验(venereal disease research laboratory，VDRL)、快速血浆反应素试验(rapid plasma reagin Test，RPR)和甲苯胺红不加热血清试验(toluidine red unheated serum test，TRUST)等。在临床应用中，VDRL试剂需现配现用，对待测血清的新鲜度要求高且需要加热灭活，而RPR和TRUST经济、方便、快捷[7]。最近，有一项荟萃分析[9]显示VDRL对一期梅毒的敏感性为62.5%～78.4%，对二期梅毒的敏感性可达100%，对三期梅毒的敏感性为47%～64%；RPR对一期梅毒的敏感性为62.5%～76.1%，对二期梅毒的敏感性也可达到100%；TRUST的敏感性与RPR一致。可见，在不同研究中，三种方法的敏感性差异不大；在大多数情况下，RPR/TRUST可替代VDRL。因此，目前实验室已很少使用VDRL，但其对神经梅毒的检查具有重要意义，我国2020 年梅毒诊疗指南指出在无条件做VDRL的情况下，可用RPR/TRUST替代[6]。

大量临床数据显示，该类试验存在一定的生物学假阳性率，易受恶性肿瘤、荨麻疹、皮炎、湿疹、脑梗塞、系统性红斑狼疮、巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血、老年和妊娠等60多种生理或病理因素影响，即使通过重复试验也无法避免[10]。此外，也存在前带现象而造成漏检。Liu等[11]通过对46 856例的梅毒血清RPR前带现象研究，发现约31%前带现象的滴度≤1 ∶16，即中度或较低抗体滴度也可能导致前带现象，提示患者血清中的抗体过多并不是其发生的单一原因。此外，该项研究还显示，前带现象的出现与疾病的病程有关，特别是在梅毒孕妇及神经梅毒患者中更易出现，其发生机制有待进一步研究。

值得注意的是，早期研究发现梅毒非特异性抗体滴度随治疗逐渐下降，梅毒患者治愈后其非特异性抗体滴度在6个月或12个月会有4倍或8倍的下降[12]，因此将非特异性抗体(如RPR)转阴或4倍滴度下降作为疗效监测指标[7]，广泛被临床医生接受，并被一些国内外的指南推荐[6-7, 13]。然而，Lin等[14]采用兔感染模型，发现感染兔无论是否治疗，其RPR的变化趋势相似，都存在4倍下降或转阴的可能，且感染兔治疗后RPR滴度下降4倍甚至转阴后，其淋巴结转种依然能感染新的兔子，提示梅毒非特异性抗体作为疗效监测指标值得商榷。寻找有效的梅毒治疗监测指标将成为梅毒研究的热点。

1.2 梅毒特异性抗体试验

人体感染Tp后产生IgM和IgG抗体。IgM抗体在感染后2～4周产生，常作为梅毒早期感染并活动的一项免疫学指标；IgG抗体在IgM抗体产生后两周出现，反映梅毒感染病史，是梅毒流行病学调查的重要依据。与梅毒非特异性抗体试验相比，梅毒特异性抗体试验具有较高的敏感性和特异性。特异性抗体的生物学假阳性罕见，偶尔可出现于肿瘤、免疫异常、病毒性肝炎和糖尿病患者中[15]。需要注意的是，此类试验的阳性结果可能持续较长时间，甚至终生，因此不被推荐用于评价梅毒的疗效[7]。目前国内外常用的梅毒特异性抗体检测方法包括梅毒螺旋体明胶凝集试验(Treponemapallidumparticle assay，TPPA)、梅毒螺旋体荧光抗体吸收试验(fluorescent treponemal antibody-absorbed，FTA-ABS)、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验(Treponemapallidumenzyme linked immunosorbent assay，TP-ELISA)、梅毒螺旋体化学发光免疫分析(Treponemapallidumchemiluminescence analysis，TP-CLIA)和梅毒螺旋体免疫印迹试验(Treponemapallidumwestern blot，TP-WB)等。

由于梅毒螺旋体血凝试验(Treponemapallidumhaemagglutination assay, TPHA)对一期梅毒的检测效能不佳，常发生自凝现象，假阳性率较高[16]，现已被其改良方法TPPA替代。TPPA在试剂制备过程中排除了多种非特异性干扰，对各期梅毒的敏感性达84.5%～100%，特异性达94.0%～100%[16]，是目前全球范围内广泛被认可和应用的梅毒筛查试验或确证试验方法[17]。FTA-ABS排除了同属抗原交叉反应的可能，且利用的是完整的Tp进行检测，对各期梅毒的敏感性为78.2%～100%，特异性为92.0%～100%[16]，但操作复杂且对操作者要求高。TP-WB采用多种高度纯化的重组Tp抗原，具有较高特异性和敏感性，但其存在成本昂贵、结果显示不明确等局限性[7]。有文献指出，TP-WB法检测正常人、抗核抗体阳性、类风湿因子阳性和其它螺旋体感染的患者血清标本均为阴性反应，提示其生物学假阳性较低[18]。此外，TP-WB法检测TP-IgM抗体时，不受IgG抗体存在的影响，是诊断先天梅毒的良好试验。但此三者均存在成本较高、操作相对繁琐和不易实现自动化等局限性，很难在临床上全面推广和应用，可作为有条件的实验室的补充实验。

TP-ELISA/CLIA较好解决了应用受限的问题。有文献指出，TP-ELISA对各期梅毒的敏感性为98.56%，特异性为99.77%；其纯化的基因重组抗原提高了试验的特异性，酶的放大效应提高了试验的灵敏度[19]。该方法由检验仪器自动化操作，结果客观准确，适合大规模梅毒筛查；但不同厂家的试剂盒质量参差不齐，临床使用前应对其进行评估。研究表明[20]，TP-CLIA 检测各期梅毒特异性抗体的敏感性和特异性均在99%以上，已经成为国外检测梅毒特异性抗体的主要方法，国内也逐年增加应用，可作为大规模梅毒特异性抗体检测首选筛查试验[21]。但也有报道显示，TP-CLIA与TPPA的检测结果存在不一致性，TP-CLIA检测早期或隐性梅毒抗体的敏感性较TPPA高，但前者在检测特异性方面存在一些问题，即TP-CLIA筛查出的弱阳性标本，复查TPPA为阴性结果[22]，因此实验室需根据自身情况，验证试剂厂家提供的灰区范围甚至制订最佳临界值。在此基础上建立起来的微粒子化学发光免疫法(CMIA)是近年来应用于检测梅毒特异性抗体的一项新技术，自动化程度高，检测简捷，有潜在的应用前景。以上三种检测技术检测的是Tp总抗体，即不区分Ig G/M，不适用于新生儿的梅毒特异性抗体检测，不利于先天梅毒的早期诊断。鉴于此，IgM捕捉ELISA法是其良好的补充试验。值得注意的是，若感染时间较长，体内TP-IgM抗体可能降低到检测限以下，因此单用TP-IgM抗体诊断隐性梅毒易出现漏诊，必须结合RPR及TPPA结果。

1.3 梅毒血清学临床应用策略

鉴于存在梅毒感染窗口期和不同检测方法的局限性等因素，使用单一血清学方法进行筛查和(或)诊断，均存在漏检或误检的可能，需要应用两种及以上的试验来完成确认，即实验诊断程序(或策略)，包括传统、逆序和第三种诊断程序。

传统实验诊断程序是以非特异性抗体试验(如RPR)作为初筛试验，特异性抗体试验作为确认试验[23]。原则上，筛查试验应追求无限的灵敏度，允许一定量假阳性，但应尽可能减少假阴性结果。如前所述，梅毒非特异性抗体试验的敏感性受感染阶段和检测时间等影响，较特异性抗体试验低，且存在前带现象，不宜作为筛查指标。因此，美国性传播疾病治疗指南(2015版)推荐有条件的临床实验室应用逆序实验诊断程序[24]。

逆序实验诊断程序是采用特异性抗体试验作为初筛试验，而非特异性抗体试验作为确认试验。当二者结果不一致时，再以第2种不同的特异性抗体试验进行判定[23]。不可否认，此法相较于传统实验诊断程序来说具有更高的灵敏度和特异性，且更易实现自动化和高通量检测；但特异性抗体阳性的患者，其非特异性抗体不一定阳性。因此，在实验诊断中，特异性抗体初筛后，再以非特异性抗体进行确认，可能是不必要的检查。

针对上述问题，Tong等[25]提出第三种实验诊断程序，即以梅毒特异性抗体试验(如TP-CLIA或TP-ELISA)作为初筛试验，第2种不同的梅毒特异性抗体试验作为确认试验。该文献通过对24 124例筛查患者的横断面调查研究，发现此诊断程序的诊断准确性高达99.93%，与逆序诊断程序的一致性为99.9%，都有较高的诊断效能，但节省了反应素检测的环节，并有效地杜绝了反应素检测的生物学假阳性和前带现象。值得一提的是，该方案已被欧洲梅毒管理指南(2020版)和加拿大公共卫生实验室指南(2015版)所推荐[7, 13]。

2 神经梅毒的免疫学检测

近年来，随着对梅毒免疫学的深入研究，学者们发现梅毒疾病进展与患者细胞免疫间有着密切的联系。在恶性梅毒和严重的神经梅毒等情况下表现出CD4+、NK和CD4+/CD8+比值下降，CD8+升高以及IL-2、TNF、IFN等Th1型细胞因子分泌减少和IL-4、IL-6等Th2型细胞因子大量产生[26]。因此，这类感染指标适用于疾病严重程度的评估及进展的监测。有研究发现Th17细胞以及IL-17在梅毒患者外周血中高度表达，对疾病的发生发展起着重要作用[27]。此外，脑脊液中趋化因子配体CXCL-13的浓度升高可作为神经梅毒的参考诊断依据[6]。

值得注意的是，从临床数据和动物实验中均发现免疫细胞因子的变化对梅毒的诊断具有一定参考价值。有学者发现巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)或可作为HIV阴性神经梅毒患者的脑脊液(CSF)标志物，该研究发现CSF-MIF在神经梅毒诊断中的敏感性为74.42%，甚至高于CSF-RPR(39.53%)、CSF蛋白水平异常(48.84%)和CSF白细胞增多(67.44%)[28]。总之，免疫细胞和细胞因子有望成为梅毒诊断新的生物标志物。

3 梅毒螺旋体抗原试验

抗原作为病原体的组成部分，出现时间较早，检测不受机体免疫效应的影响，有些抗原的多少与病原体的存活状态密切相关。近年来，随着分子生物学技术的发展，涌现出新的梅毒重组蛋白如感染依赖性抗原、黏附蛋白和鞭毛蛋白等[29]。Liu等[30]利用兔感染模型发现Tp感染依赖性抗原(Tp0971、Tp0768)对早期梅毒和潜伏感染的诊断具有重要意义。Jiang等[31]研究发现鞭毛蛋白Tp0463在先天梅毒中表现出良好的诊断价值。外膜蛋白Tp1038、Tp0868和Tp0965也被证实对晚期梅毒和隐性梅毒有良好检出率[32]，其中Tp0965对血清学反应的敏感性为98.8%，特异性为87.5%，并且在各期梅毒患者诊断的灵敏度和特异性均较高[32]。这为梅毒诊断提供新思路，即针对Tp在不同感染时期形成的蛋白表达谱不同的特点，应用蛋白质组学技术(如Label-free质谱法结合免疫印迹)，检测不同感染阶段所表达的抗原或以其作为该阶段的标志物检测相应的抗体，对梅毒感染的分期具有重大意义，因此该类检测的发展前景良好。另外，可通过蛋白质芯片技术高通量检测Tp抗原物质，具有潜在的前景。

4 结语与展望

梅毒被称为伟大的模仿者[33]，不能仅根据流行病史和临床表现而确认，梅毒实验室检测在梅毒诊断中占重要地位。Tp尚不能在体外进行长时间培养，病原体的形态学检查受样本取材等限制，灵敏度低。Tp感染后所产生的免疫反应，成为确定Tp感染的重要依据。梅毒的免疫学实验诊断除了已纳入指南的梅毒血清学试验外，还包括近年来研究发现的新的梅毒标志物，如免疫细胞分群、免疫细胞分泌的细胞因子(IL-17、CXCL-13和MIF等)和Tp抗原等。完善传统的免疫学检测试验、开展新的免疫学感染指标研究和探索潜在的免疫诊断标志物对各期梅毒的诊断及其疗效判断具有重大意义。