CircRNA在结直肠癌中的研究进展

袁晨磊，赵 鑫

（1.苏州大学医学部，江苏 苏州 215123；2.苏州大学附属第一医院胃肠外科，江苏 苏州 215006）

结直肠癌是世界范围内常见的消化系统恶性肿瘤。2021年发布的美国癌症统计数据显示，目前结直肠癌发病率在消化系统癌症中居于首位，死亡人数占全部恶性肿瘤死亡人数的8.7%[1]。在中国，结直肠癌的发病率仅次于肺癌和胃癌，位居所有恶性肿瘤的第3位，并且发病率还在不断上升[2]。近年来肠镜检查的普及以及腹腔镜手术的发展，结直肠癌的手术效率、术后临床疗效和患者预后都有了显著的进步[3]。在过去几十年中，人们对结直肠癌的发病机制的认识取得了一些进展，然而有效的治疗措施依旧有限[4-5]。但积极的是，包括化疗和免疫治疗等治疗手段的进步，使目前结直肠癌的5 年生存率可以达到65%[6]。尽管近些年对于结直肠癌的病因有所阐述，包括不合理的饮食习惯，没有进行充足的体育运动，体内微生物及其代谢以及社会心理因素等[7-9]，但是影响结直肠癌发展具体的分子机制还不明确。因此阐明结直肠癌发展的分子机制极为重要。

Circular RNA（circRNA）是一种新发现的具有共价闭环结构的非编码RNA，广泛存在于人体细胞中[10]。cricRNA由前体mRNA反向拼接转录，具有结构稳定、序列保守、组织特异性强的特点。最近的研究表明，circRNA可以作为microRNA的海绵，抑制microRNA的活性，调节基因转录以及结合RNA结合蛋白等功能[11-12]。作为一种新型的调控分子，circRNA在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用，有望成为一种新型的肿瘤标志物和潜在的靶点，为肿瘤诊断和靶向治疗提供新的方向[13]。CircRNA在基因调控中起着至关重要的作用，如作为miRNA海绵吸附miRNA，调控相关基因以及多肽的表达等[14]。研究表明，CricRNA可以作为一些癌症的新型治疗靶点，如肝细胞癌、非小细胞肺癌，口腔鳞状细胞癌以及结直肠癌等[15-17]。在这篇综述中，总结了circRNA在结直肠癌恶性发展中的机制和作用。

1 CircRNA在结直肠癌中的角色

已有的研究表明，circRNA在结直肠癌的发生和发展过程中发挥了很大作用[18]。一项研究通过使用Arraystar circRNA微阵列分析，确定了1 817 个在结肠癌组织中具有明显不同表达谱的circRNA，其中1 236 个上调，581 个下调[19]。CircRNA在结肠癌中参与调控细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤侵袭性和转移、细胞周期、癌症干细胞以及上皮-间充质转化（EMT）。这一部分将具体阐述cricRNA在这些细胞过程中的作用并分析circRNA在结直肠癌中的机制。

1.1 CircRNA调控细胞增殖 很多研究表明circRNA在结直肠癌细胞增殖中起到重要作用。Zheng等[20]通过实时荧光定量PCR实验、CCK8检测实验以及细胞克隆形成实验研究发现，circPPP1R12A的表达加速了DLD-1、Caco-2、HCT-116和LoVo结肠癌细胞的增殖。另外，沉默circPPP1R12A也可抑制结肠癌细胞的增殖能力[20]。与之相似的，通过下调circRNA-ACAP2的表达，可明显减弱结肠癌细胞SW480的增殖性[21]。另一项研究发现，cricRNA CBL.11作为miR-6778-57的竞争性内源RNA调控结肠癌细胞的增殖[22]。CircRNA CBL.11在结肠癌细胞中低表达，释放miR-6778-57，Li等[22]通过CCK-8试验显示，与对照组相比，miR-6778-5p能显著提高结直肠癌细胞的活力。相反，miR-6778-5p的抑制剂显著抑制了结直肠癌细胞的增殖。此外，EdU结合试验显示，miR-6778-5p模拟物增强了HCT116细胞的增殖，但受到其抑制剂的抑制作用而受损。这些结果表明，circRNA CBL.11通过调控miR-6778-5p增强结直肠癌细胞的增殖性。

Circ_0055625可以通过miR-106b/ITGB8通路调控结肠癌细胞的增殖。Circ_0055625的敲除、miR-106b的高表达，以及ITGB的低表达都被证明能够抑制结肠癌细胞SW480和HT29的增殖[23]。Circ_0055625在结肠癌细胞中高表达，并作为miR-106b海绵，ITGB作为miR-106b的靶基因在circ_0055625高表达时数量增加，调控结肠癌细胞的增殖性[23]。相似的另一项研究[24]发现，circ_000166作为miR-330-5p海绵调控结肠癌细胞的增殖能力。Zhao等[24]通过CCK8检测实验证实了cric_000166的敲除可以显著降低结肠癌细胞HT29和HCT166细胞的增殖能力，另外转染RNA实验证实了cric_000166通过吸附miR-330-5p使其下游靶基因ELK1表达增加，从而增加了结肠癌细胞的增殖能力。

综合以上的研究，证明了circRNA在调控结肠癌细胞增殖性方面起到了关键的作用。

1.2 CircRNA调控细胞凋亡 CircRNA据报道参与调控结肠癌细胞的凋亡。Tu等[25]研究发现，circ_0001313在结肠癌细胞中高表达，circ_0001313作为miRNA-510-5p海绵与其竞争性结合，上调miRNA-510-5p的靶基因AKT2的表达，转染siRNA AKT2明显降低了SW480和HCT116细胞中AKT2的表达。有趣的是，AKT2对结肠癌细胞凋亡的影响与circ-0001313相似，与miR-540-5p有相反的影响。沉默AKT2显著诱导细胞凋亡，而miR-510-5p敲除则明显抑制细胞凋亡。更重要的是，miR-510-5p可以逆转circ-0001313对结肠癌细胞凋亡的调控，Caspase-9活性的变化趋势与流式细胞仪得到的结果相同。以上数据意味着，cric_0001313通过circ-0001313/miR-510-5p/AKT2通路调控细胞凋亡[25]。与其相似的另一项研究发现，过表达的cric_104916调控结肠癌细胞的凋亡，而cric_104916在结肠癌细胞中低表达，抑制细胞凋亡通路，从而调控结肠癌的进展[26]。

1.3 CircRNA调控肿瘤侵袭性和转移 CricRNA已被证明在调控结肠癌细胞的侵袭性和转移方面具有关键作用。一项研究[28]表明，circPTK2（circ_0005273）促进结直肠癌细胞的侵袭性和转移，circPTK2的敲除抑制了肿瘤的发生和转移能力。Yang等[27]通过结肠癌肝肺转移实验，采用表达荧光素的SW620结肠肿瘤细胞系，在雌性裸鼠中正交生成肿瘤，结果显示，cricPTK2敲除可分别明显钝化脾内注射后的自发肝转移或尾静脉注射后的肺转移。Fang等[28]的研究发现circRNA_100290在结肠癌中通过形成circ_100290/miR-516b/FDZ4/Wnt/β-catenin通路调控结肠癌细胞的侵袭性。Cric_100290在结肠癌细胞中高表达，circ_100290为miR-516b的海绵，miR-516b靶向FZD4，cric_100290通过抑制miR-516b促进FDZ4的表达，从而激活Wnt/β-catenin通路，增加结肠癌细胞的侵袭性[28]。

He等[21]为了确定circRNA-ACAP2、Tiam1和miR-21-5p表达对SW480细胞入侵的影响，用表达sh-circRNA-ACAP2、sh-Tiam1或miR-21-5p的慢病毒载体转染SW480细胞，进行划痕实验和Transwell实验，发现下调circRNA-ACAP2和Tiam1的表达以及上调miR-21-5p的表达后，结肠癌SW480细胞的转移和侵袭性被显著抑制，证明circRNA-ACAP2/hsa-miR-21-5p/Tiam1反馈回路在结肠癌细胞的侵袭性和转移中起着关键作用。另一个相似的研究[18]表明circ_0071589调控结直肠癌细胞的侵袭性和转移。Wang等[18]通过Transwell实验和划痕实验证明circ_0071589的沉默能显著降低结肠癌HCT116细胞的侵袭性和转移能力。

1.4 CircRNA调控细胞周期 CircRNA已经被发现参与调控结肠癌细胞的细胞周期。Circ_104916可以通过激活细胞周期蛋白调控结肠癌细胞周期G2/M期阻滞，从而阻止结肠癌细胞增殖[26]。

另一项研究中，Wang等[29]通过功能获得实验证明，circ_0014717的过表达可以显著抑制结直肠癌细胞增殖和菌落形成，并在体外诱导细胞周期G0/G1期停滞，在体内抑制异种移植瘤生长。此外，circ_0014717还可以上调细胞周期抑制蛋白p16的表达。

Li等[30]的研究数据表明，结直肠癌细胞周期在circRNA_102209的敲除下，明显从S期和G2/M期向G0/G1期转移，G0/G1期的细胞比例明显升高，而S期的细胞比例明显下降。此外，流式细胞仪的结果表明，敲除hsa_circRNA_102209会增加结直肠癌细胞的凋亡率，而Bax、Cas-9和MMP9等凋亡相关分子的上调也进一步证实了这一点。这些数据揭示了circRNA_102209敲除可能会使细胞周期在G0/G1期停止，从而促进结直肠癌细胞的凋亡[30]。

1.5 CircRNA调控癌症干细胞 越来越多的证据揭示了癌症干细胞的存在及其在赋予治疗抵抗力方面的作用。癌症干细胞是癌细胞的一小部分，它使肿瘤异质性得以实现，并启动肿瘤的形成[31]。在新出现的证据中，肿瘤干细胞对肿瘤侵袭性、转移以及复发起到关键作用，circRNAs已经被验证参与了结直肠癌等人类癌症中肿瘤干细胞的形成和维持。Zhan等[32]研究发现，circCTIC1敲除后损害了结肠肿瘤起始细胞（tumor-initiating cells, TICs）的自我更新，而其过度表达则起到相反的作用。circCTIC1与核重塑因子（NURF）复合物相互作用，将NURF复合物招募到c-Myc启动子上，最终驱动c-Myc的转录启动[32]。

1.6 CircRNA调控EMT过程 EMT是上皮细胞转变为间质细胞，使其具有迁移和转移能力的细胞过程。CricRNA被证实在结直肠癌细胞EMT过程中发挥重要作用。Li等[30]为了研究hsa_circRNA_102209基因敲除对结直肠癌细胞EMT的影响，考察了E-cad、vimentin和snail等相关标志物的表达水平。转染si-hsa_circRNA_102209后，上述分子的蛋白和mRNA水平均受到影响。由此得出敲除hsa_circRNA_102209可导致结直肠癌细胞EMT的下调。

Zhou等[33]通过生物信息学和双荧光素酶报告实验证实，circRNA_100859作为miR-217海绵，miR-217直接靶向缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），circRNA_100859的高表达释放HIF-1α。而HIF-1α可通过激活PI3K/PKB/GSK-3β/Snail1信号通路促进结肠癌HCT116细胞EMT[34]。

2 CricRNA在结直肠癌中的临床作用

CricRNA在最新的研究中被证实可以作为结直肠癌诊断，治疗以及预后的生物标志物。

血浆circRNA面板可作为结直肠癌的新型诊断生物标志物，Lin等[35]研究发现，与健康对照组（n＝61）相比，结直肠癌患者（n＝45）血浆中3种circRNA（circ-CCDC66、circ-ABCC1和circ-STIL）的水平明显下降。ROC曲线分析显示，三种circRNA面板的ROC曲线下面积（AUC）为0.780，高于传统的蛋白质生物标志物，如癌胚抗原（CEA）和碳水化合物抗原19-9（CA19-9）。将circRNA面板与CEA和CA19-9相结合，可能会提高诊断结直肠癌的能力（AUC＝0.855）。此外，血浆circ-ABCC1水平与肿瘤生长和进展有关，结直肠癌的前驱病变，包括结肠腺瘤和腺瘤性息肉，血浆circ-CCDC66和circ-ABCC1水平下降。更重要的是，circ-CCDC66和circ-STIL对早期结直肠癌的诊断有帮助，三circRNA面板提高了对CEA阴性和CA19-9阴性结直肠癌的诊断能力。

在Ruan[36]的研究中，对肿瘤和邻近正常组织中的437 个结肠癌circRNA进行了检测，发现与非复发的结肠癌患者相比，103 个circRNAs在复发的结肠癌患者中表达有差异。其中，在Ⅱ/Ⅲ期结肠癌患者中验证了100 个上调的circRNAs，以测试它们是否可以作为预后生物标志物。在验证队列中，包括hsa_circ_0122319、hsa_circ_0087391、hsa_circ_0079480和hsa_circ_0008039在内的4 个circRNA对无病生存期（DFS）有较强的预测价值。由此发现了一个基于4-circRNA的表达特征，对Ⅱ/Ⅲ期结肠癌的癌症复发具有高度的预测性，具有识别高危早期结肠癌个体的潜力，这些个体将从辅助化疗中获益最大。

3 结语

综上所述，circRNAs在结肠癌的发生和进展中起着至关重要的作用。靶向circRNAs可能有助于提升结直肠癌患者的治疗效果[13]。然而，对于cricRNAs的研究，目前也存在以下几个方面的不足。首先circRNAs在结直肠癌发展中的作用机制非常复杂，可能是由于不同亚型在结直肠癌进展中的作用机制存在差异性，许多结直肠癌相关的circRNA的作用机制尚未报道，因此需要逐一报道。另外，circRNAs在临床当中是否足以作为生物标志物用于治疗需要验证，目前将circRNAs作为靶向药物在临床上使用还未报道，circRNAs与常规的生物标志物相比是否具有优势需要确定。但是我们乐观地认为，新的和强大的测序技术的使用将阐明在结肠肿瘤的发生中参与的circRNAs的作用，可能促进circRNAs的临床应用，用于诊断、治疗和预后评估。