PCP信号通路关键因子VANGL在肿瘤细胞迁移和增殖中的作用研究进展

沈书凝,徐步捷综述,郝雷雨,朱一超审校

0 引 言

肿瘤细胞的增殖和迁移是肿瘤生长和转移的细胞学基础。肿瘤细胞通过平面细胞极化(planar cell polarity, PCP)通路，形成不对称的趋向性。Vangl蛋白是PCP通路的一个关键因子，其非对称分布与肿瘤细胞的迁移方向密切相关。本文主要介绍了Vangl的分子结构、在PCP通路中的功能，以及总结了Vangl影响肿瘤生长和转移的最新研究方向。

1 VANGL简介

1.1 VANGL的发现1998年，Wolff和Rubin在果蝇中发现Strabismus(STBM)，这种基因能调节果蝇的复眼、鬃毛等部位亚单位的极性分布，且能决定复眼中R3、R4光感受器的细胞结局(旋转方向等)[1]。同年，Taylor等[2]在果蝇翅膀中发现同一基因并命名为Van Gogh(VANG)。序列分析发现该基因在进化中具有高度保守性，在哺乳动物(如人、小鼠、斑马鱼等)中存在VANG同源基因VANG-like(VANGL)，其具有两种亚型——VANGL1和VANGL2[3-4]。VANGL1和VANGL2在分布上既有重合也有不同。VANGL1主要分布在神经管腹侧(中线底板区)和脊索；而VANGL2在神经上皮中分布更广泛，但不分布于脊索。在部分组织(如耳蜗感觉上皮)，VANGL1和VANGL2均有分布，且二者在细胞膜可形成蛋白聚合体[5]。

1.2 VANGL的肽链结构VANGL为四次跨膜蛋白，以VANGL1为例，其肽链拓扑结构已研究清楚，VANGL2与VANGL1序列相似度很高。VANGL1可划分为胞内的N端(pst.1-114)、C端(pst.242-524)、1个短loop环(pst.173-186)以及胞外2个短loop环(pst.135-152；207-221)[6]。N端和C端各存在一些结构域与细胞膜靶向信号和蛋白质分选有关，参与网格蛋白(一种囊泡蛋白)介导的胞吞作用，包括：N端YSFG(pst.7-10)、YSYY(pst.10-13)、LL双亮氨酸模体(pst.56-57)；C端YKDF(pst.284-287)、NPNL(pst.291-294)[6]。

VANGL的C端序列高度保守，可与胞质内蛋白结合传递信号，如PCP相关因子Prickle(PK)、Dishevelled(DVL)[7]、垂直极化因子Scribble等[8]。C端尾部有一个PDZ结合结构域(PDZ-binding motif，PBM)，许多蛋白均有多个PDZ结构域，如Scribble等，但其与VANGL的相互作用是否必须通过VANGL的PBM尚有争议。相比于N端，C端在VANGL的膜定位靶向运输中发挥更重要的作用。VANGL1部分截短实验发现，N端缺失突变的VANGL1在膜表面的分布正常，而C端缺失突变的VANGL1转运失败，滞留于内质网中[9]。

1.3 VANGL的膜稳定性影响其功能实现

1.3.1 VANGL从内质网到膜表面分布的转运VANGL的功能实现与其在膜表面的定位分布密切相关。膜蛋白在胞膜的分布及稳定性由两方面因素影响：一是内质网-高尔基体-胞膜的囊泡运输过程，二是细胞内吞-蛋白酶体/溶酶体分解蛋白途径。VANGL2在内质网合成后，由COPII囊泡运输至高尔基体，而由内质网转移入囊泡的过程需要Sec24b[10]。Sec24b是COPII囊泡的一个亚单元，用于分选装载蛋白。VANGL2-Looptail(LP)双等位基因突变鼠，三种突变位点(VANGL2的D255E、R259L、S464N)不能被分选打包进COPII囊泡，滞留于内质网，不能表达于细胞膜上，因而VANGL2-PCP功能缺陷，造成严重的神经管形成缺陷，在胚胎期小鼠就死于颅脊柱裂。

VANGL2从转运高尔基体到胞膜的囊泡运输需要ARFRP1(GTP结合蛋白ADP糖基化因子相关蛋白1)和AP-1(网格蛋白相关适配蛋白复合体1)的参与[11]。ARF蛋白结合GTP后构象变化，暴露出N端脂质结合结构域，与装运高尔基体膜结合，同时switch结构域改变其朝向，招募胞质内装载调节蛋白。ARFRP1与AP-1相互作用，使AP-1与VANGL2 C端YYXXF(pst.279-283)分选信号结构域相结合，从而抓获VANGL2装载到转运囊泡中[11]。此外，支架蛋白PDZ蛋白家族的NHERF1(Na+/H+Exchanger Regulatory Factor 1)通过2个PDZ结构域分别与VANGL2和Frizzled4的PDZ结合位点结合，连接VANGL2和FZD4，从而促进VANGL2向胞膜的转运[12]。

1.3.2 细胞外基质对VANGL的影响VANGL2可与整合素αv相互作用，调控细胞与细胞外基质的黏附。反之，整合素αv也可作用于抑制VANGL2的降解，维持其在胞膜的表达量；敲除整合素αv或整合素β5都可发现VANGL2蛋白表达量减少[13]。细胞外基质可能通过整合素与细胞连接和影响细胞内VANGL的表达。

2 VANGL在PCP信号通路中的角色

上皮细胞在发育形成过程中会朝两个方向轴产生不对称性极化：垂直方向顶-基底轴和平面近-远端轴。其中，沿平面轴(垂直于顶-基底轴)进行细胞形态和内含物的非对称发育称为PCP[14]。这种非对称性发育，为细胞整体的非对称功能分区形成结构基础。进一步研究发现除上皮细胞以外，间叶细胞、肿瘤细胞等其他细胞都广泛存在PCP通路。

PCP信号通路建立的重要基础是其核心分子的非对称分布。VANGL是PCP信号通路的一个核心分子，其他分子包括：Frizzled(FZ)、Flamingo(FMI/Starry night，STAN/CELSR)、Dishevelled(DSH/DVL)、Prickle(PK)、Diego(DGO/Diversin，Inversin)。其中，FMI、FZ、VANG位于胞膜，DSH、DGO、PK位于胞质内，胞膜蛋白接受信号后由胞质内蛋白传递和放大信号，细胞间信号传递则进一步放大信号到邻近组织。这些蛋白又分为两个亚组：FMI-FZ-2DSH-1DGO(FZ在胞膜接受信号后募集胞内2分子DSH和1分子DGO)；FMI-6VANG-1PK(VANG在胞膜接受信号，且需6个VANG召集1个PK)[15]。这样的数量关系意味着VANG需要联合起效，其数量的减少与其他PCP蛋白相比更敏感，更容易影响信号的传递。

FZ组位于细胞的远端/后部，VANG组位于细胞的近端/前部，呈相互对立的分布。且其分布与胞外WNT浓度梯度相关，FZ组位于WNT高浓度一端，VANG组位于WNT低浓度的一端。两组蛋白相互拮抗，竞争胞外信号，但又相互影响调控，最终共同完成前、后两个方向上的PCP。相邻细胞的FMI之间相互黏附形成跨细胞FMI-FMI桥，从而拉近相邻细胞的FZ和VANG，跨细胞传递PCP信号。在细胞迁移过程中，PCP关键蛋白在细胞伸出的伪足中呈非对称分布，如乳腺癌细胞的伪足中，FZ6位于伪足尖端，而VANGL2位于伪足的侧缘[16]。

除核心分子之外，PCP还有一套信号传递系统，即Fat-Dachsous(FT-DS)。FT与DS类似于FZ与VANG的位置关系，即胞内非对称分布，相邻细胞的FT和DS可形成跨细胞连接。这组分子能独立于核心分子组传递PCP信息，也能通过调控微管重组迁移的方向，影响微管介导的PCP核心分子FZ组所在囊泡的定向转运[17]。

指导建立PCP的信息来源有几种猜想：WNT、FT-DS、细胞周围组织的机械力环境等。其中WNT与PCP核心分子调控的关联性研究较多，但明确性的PCP起始驱动力来源还处于探索中。PCP产生的细胞极性在内耳听毛朝向、气管/脑室中纤毛的运动等方面有重要影响。但PCP不仅在建立上皮细胞极性方面有重要作用，还参与胚胎发生过程中的汇聚伸展运动，即细胞侧向插入使细胞群沿前后轴延长。PCP核心分子的功能失调直接导致PCP建立障碍，继而影响胚胎发育，如原肠胚形成、神经管闭合。VANGL是人类基因中唯一被发现与神经管缺陷相关的基因，VANGL1突变可导致脊柱裂[18]，VANGL2在神经管闭合中的作用比VANGL1更为关键，其突变可直接导致胎儿死亡[19]。

3 VANGL与肿瘤的联系

3.1 VANGL与肿瘤细胞迁移的关系动物实验及临床数据分析发现VANGL与多种肿瘤的侵袭及转移相关，但VANGL通过何种机制影响肿瘤的生长和转移尚处于探索阶段。如VANGL1(KITENIN)在胃肠道肿瘤(如结肠癌、胃粘膜瘤)[20]、头颈部鳞状细胞癌[21]、胆管癌[22]中过表达，且促进了后三者的侵袭和转移。另外，胶质瘤患者的VANGL1水平高低也与其肿瘤进展呈正相关[23]。研究发现VANGL可促进肿瘤的血管和淋巴管生成，促使结直肠癌的转移[24]，这可能是VANGL影响肿瘤迁移的其中一种机制。

VANGL与乳腺癌的联系报道较多，相较于其他肿瘤性疾病关联性较大。VANGL2在乳腺癌上皮细胞中表达丰富，但其分布不均一，在基底层细胞和间叶细胞中比导管上皮表达更丰富[25]。VANGL2与女性生殖系统、性腺癌症有较大的关联，在乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌中表达均上调，且侵袭性乳腺癌中VANGL2表达上调最明显(24%表达上调，236/988)[26]。VANGL1与乳腺癌的关系则不如VANGL2突出，VANGL1表达水平与总体乳腺癌患者的总生存时间相关性不明显，但高VANGL1表达与ER(+)乳腺癌患者的总生存时间下降相关[26]。雌激素与VANGL的关系和影响机制尚不明确。细胞实验进一步证明VANGL1与乳腺癌细胞的迁移相关，VANGL1敲除后的MDA-MB-231人乳腺癌细胞的迁移力下降。在划痕实验中VANGL1与Scribble、NOS1AP形成复合物，位于向划痕延伸的伪足前缘[27]，调节癌细胞迁移并控制细胞极性(迁移方向)。该复合物只在病理条件下形成，而正常的乳腺细胞中NOS1AP不在细胞膜细胞连接处表达。

VANGL可与垂直极化因子Scribble、aPKC[28]相互作用，可能通过影响细胞顶—基底极化，使肿瘤细胞失去垂直极性，从上皮细胞向间叶细胞转变，进而增加侵袭和迁移的可能性。这为VANGL 影响肿瘤细胞迁移的分子机制提供了PCP信号通路以外的一个探索方向。

3.2 VANGL与肿瘤增殖生长的关系除迁移外，VANGL在细胞增殖(肿瘤生长)方面也有一定作用，能通过下游细胞内信号通路调节肿瘤干细胞的生长和自我更新。如横纹肌肉瘤中，经典WNT/β-catenin通路一般被抑制，若激活则可诱导肿瘤的分化；非经典WNT/PCP通路则恰恰相反，其核心成员VANGL2位于TPC细胞分裂末期的细胞两极，呈高表达，能激活下游RHOA，维持TPC的非分化增殖，敲降VANGL2能抑制TPC增殖而诱导分化[29]。

此外，VANGL2能通过p62/SQSTM1招募和激活JNK，进而促进细胞增殖。在细胞极性较低的乳腺癌细胞SKBR7中，VANGL2经蛋白酶体途径降解多位于胞内囊泡中，而正常情况下本该定位于细胞膜的VANGL2很少，VANGL2与p62/SQSTM1共表达于晚期内体中。作为对照，细胞极性分化较好的IMCD3细胞中VANGL2被招募到细胞膜上细胞连接处，不与p62/SQSTM1共表达。临床数据发现VANGL2- p62/SQSTM1-JNK通路上调的乳腺癌患者未转移生存期较短[25]。

3.3 VANGL可能具有潜在抑癌作用尽管大部分实验都证明VANGL与肿瘤的进展相关，提示VANGL是一种促癌分子，一小部分研究却证明VANGL能是抑癌因子，VANGL对肿瘤的作用可能有更复杂的调控机制。肿瘤可以重新激活一些胚胎发育相关通路，如WNT信号通路，来促进干细胞样增殖和促进侵袭。VANGL所在的WNT/PCP通路是非经典WNT信号传导的一种，此外还有WNT/Ca2+通路等。非经典WNT信号通路是相对于经典WNT/β-catenin信号通路而言的，非经典WNT信号传递不需要依赖β-catenin。经典WNT信号通路对细胞增殖、分化的作用已被研究得较为透彻，而非经典WNT通路尚在探索之中，目前认为下游可通过小GTP酶RAC、RHO作用于细胞骨架的重组和细胞迁移。两种WNT通路相互拮抗，但通过共用分子DVL相互影响。

VANGL对肿瘤的抑制作用可能是通过负调经典WNT/β-catenin通路来实现的。VANGL1可通过C端PDZ结合结构域(PBM)与DVL相互作用，减少DVL在胞膜处的募集，从而可供经典WNT通路调用的DVL减少，实现对经典WNT通路的负调，且VANGL的这种负调作用独立于VANGL在PCP通路中的下游分子Prickle(PK)[7]。

WNT/PCP通路对肿瘤的作用究竟是促进转移还是负调经典WNT通路为主抑制肿瘤生长，可能与肿瘤的类型相关，在不同的肿瘤中主导力量不同。结直肠癌中，经典WNT通路占主导，非经典WNT通路的VANGL2因启动子甲基化而被抑制表达，这种异常的DNA修饰错误与不稳定微卫星灶型结肠癌亚型、BRAF突变相关。在甲基化程度较低的SW480亚型中过表达VANGL2后，肿瘤细胞增殖、转移灶形成均显著下调，且经典WNT通路指标(β-catenin、CyclinD1、c-Myc)被抑制[30]。因此VANGL在部分结直肠癌亚型中，可能通过负调经典WNT通路发挥抑癌作用，只不过这种抑癌作用在肿瘤中处于被抑制的地位。

NRDP1是一种泛素连接酶，能介导PCP通路关键因子DVL的多聚泛素化，从而形成空间位阻，阻碍DVL与细胞膜内侧磷脂酸(PA)结合，DVL下游促肿瘤迁移的通路就不得激活。多形性胶质母细胞瘤中，WNT5A与FZD7受体结合，招募DVL至胞膜并活化DVL，从而激活JNK-AP1转录、激活小GTP酶RAC1、RHOA作用于细胞骨架的重排和肿瘤细胞迁移。肿瘤中PCP关键因子VANGL上调，而NRDP1受抑制。然而研究发现，如果NRDP1存在，能干扰FZD对DVL的结合和激活，而这种抑癌作用正是通过加强VANGL与DVL的结合，从而促进DVL的泛素化失活[31]。VANGL与NRDP1作用位点位于VANGL的C端coiled-coil结构域。有趣的是，检测DVL与胞膜PA结合力的实验发现，无NRDP1时，VANGL2能促进DVL与PA结合；NRDP1和VANGL2共表达时，DVL与PA结合量显著降低，甚至低于NRDP1单独存在时DVL与PA的结合量。这可能提示NRDP1能逆转VANGL对肿瘤的促癌作用，但还需要细胞迁移实验的进一步证明。

4 结语与展望

肿瘤的发生发展多与胚胎发育通路的异常再激活相关，此类通路包括经典WNT通路、上皮-间质转变通路、PCP通路等。由于VANGL是PCP通路的关键因子，其表达/功能紊乱可能影响肿瘤的发生与终局。目前研究表明VANGL与乳腺癌的关系(迁移进展)最为密切。VANGL的促癌作用还需更多分子机制研究证实，最近研究发现可从VANGL与肿瘤外基质的关系、平面极化通路与垂直极化通路的交互关系等方面进行深入探索。此外，最新研究发现VANGL在抑癌方面也存在潜在作用，尤其是非经典通路对经典通路的负调控可能通过VANGL来实现。VANGL在促癌、抑癌的天平两端到底哪方面占优势，可能与肿瘤的具体种类和分型相关。