抗体介导骨再生的研究进展

2021-11-28陈方淳

中国医疗美容 2021年2期

杨瑶，陈方淳,3*

（1.重庆医科大学附属口腔医院，重庆，401120；2.口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆，401120；3.重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆，401120）

创伤、骨肿瘤切除、骨髓炎手术清创等多种原因造成的骨缺损仍然是临床医生所面临的一大难题。传统的自体骨和异体骨移植占每年骨移植的90%以上[1,2]。但是，骨移植有许多缺点，如供体有限、供体部位的发病率高（如感染、疼痛、出血和神经损伤）及成本较高[3]。骨组织工程旨在协调生物材料支架、细胞和分子信号的生物学优势，以介导骨再生。目前，骨组织工程有多种形式，包括基因治疗，干细胞治疗及蛋白质治疗。其中蛋白质治疗，使用生长因子或细胞因子，包括靶向运输和载体持续释放治疗蛋白。外源性骨诱导生长因子包括转化生长因子-β、血管生长因子等，他们具有良好的生物相容性，已被用于骨组织工程[4,5]。其中TGF-β超家族中的骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）在骨愈合中的作用已经被广泛研究，其中内源性BMP2在骨再生的初始级联中起着至关重要的作用[4]。有在2002年重组人骨形态发生蛋白-2 (recombinant human bone morphogenetic protein 2,rhBMP-2)和rhBMP-7已被美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准用于脊柱融合等骨相关疾病的治疗[6]。rhBMP2不仅被证明可以促进新骨形成，招募骨母细胞，而且还可以促进血管生成[7]。然而，rhBMP2使用的过程中也有一些自身局限，如使用量需超出生理剂量，在体内半衰期短、生物活性低等不足[8]。且近年来随着临床使用增多，rhBMP2的并发症报道迅速增多，发生率约为20-70%，主要包括严重水肿、骨塌陷、愈合不良、异位成骨等，严重者可致生命威胁[9]。

理想的骨再生法可以加速和扩大宿主的再生反应，但不会引起有害的副作用。对于研究者来说使用一种可以全身或者局部递送治疗药物然后激活或者结合体内内源性因子尤其是骨形态发生蛋白的骨再生方法是值得深入探索的一项研究。

免疫球蛋白G（IgG）是体液免疫的主要构成要素，具有结构保守的N-糖基化Fc端，以及两个具有特异性抗原识别能力的Fab端，包括四型（IgG1，IgG2，IgG3及IgG4），其中IgG1与IgG2为主要应用类型[10]。传统的IgG抗体治疗主要利用Fab端中和靶向抗原的作用，目前超过20多种单克隆抗体已成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病与感染性疾病等[11]。但是抗体在骨再生方面的研究较少，所以本篇文章主要是总结抗体介导的骨再生的研究现状。

1 抗体介导骨再生的概念

在2011年Freire等人针对重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP2）的不良免疫反应以及超生理剂量等问题提出了抗体介导的骨再生技术，显示了在动物模型中利用抗体捕捉内源性骨形态发生蛋白可促进骨形成的可能性[12]。首先，他们提出假设为能够参加AMOR的抗体分子必须具有下列特性:1.对内源性BMP-2有较高亲和力；2.BMP-2抗原表位能与BMP-2受体结合区域的远程；3.Ab-BMP2免疫复合物能够与骨祖细胞细胞表面的BMP2受体结合；4.Ab-BMP-2免疫复合物能够介导细胞内信号传导；5.Ab-BMP2免疫复合物对成骨分化有调节作用；6.抗体在宿主中不存在有害的局部或全身免疫反应。针对以上假设，体外实验结果显示：并不是所有的抗体形成免疫复合物后能够与细胞表面的受体结合及进一步促进骨形成；体内实验显示：与对照组相比，只有鼠源性单克隆抗体4B12和3G7可以显著增加颅顶骨缺损模型中的骨密度。此外，单克隆抗体（mAb）组显示形成骨量比多克隆抗体（pAb）组多17-24%，猜测这可能是由于pAb和mAb之间的免疫特性差异造成的，因为多克隆抗体会与许多表位反应，其中一些表位可能阻断了内源性BMP-2与其细胞受体之间的结合从而抑制了成骨。之后研究人员使用嵌合型单克隆抗体克服鼠源性单抗可能带来的潜在不良免疫反应，在大鼠颅顶骨缺损模型第6周时评估了骨充填率，鼠源性单克隆抗体组的骨充填率为7%-42%[12]，嵌合单克隆抗体为8%-46%[13]，两者成骨能力无明显显著差异，这可能是与鼠和人的BMP2基因有显著的同源性有关（92.2%）[14]。因此决定AMOR潜力的抗体的关键特征在很大程度上是未知的。此外其他研究进一步显示，抗体不仅能够将内源性BMP2招募到骨缺损区域并与之结合，还能与内源性BMP4和BMP7结合进一步增强内源性信号和促进成骨促进骨再生的能力[15]。2014年，Ansari等人评估了大鼠颅顶骨缺损局部应用1ug/ml至100ug/ml的不同剂量的单克隆抗体的成骨效能，根据组织形态学和显微CT检查结果显示了25ug/ml的浓度可以形成最大骨量，同时在抗体植入的部位发现大量的细胞浸润。且该研究在体外进一步探索了Ab-BMP2免疫复合物与C2C12细胞（成肌细胞）结合后细胞内的信号通路，结果显示Ab-BMP2免疫复合物组细胞高表达Runx2和p-Smad1，而抑制成骨细胞分化的因子Smad6的表达无明显改变[16]。因此猜测Ab-BMP2免疫复合物通过经典的Smad信号通路促进骨生成。Qingqing Wu等人进一步体外研究证明：Ab-BMP2免疫复合物与干细胞表面的BMP2受体结合后，启动细胞内BMP2/Smad/Runx2信号通路诱导细胞成骨分化[17]。但是免疫复合物具体的作用方式及通路还需进一步探索。目前，对于rhBMP2及抗体介导的骨再生所形成的骨质还有一些争议。在Ansari[16]、Freire[13]及Moshaverinia[18]等人的研究中rhBMP2和Ab-BMP2免疫复合物组及rhBMP2和抗BMP2抗体组没有观察到骨矿化的差异。但是在有的研究中发现植入rhBMP2组的颅骨缺损部位表现出异常的组织学形态，伴有营养不良型性钙化[8]。无论如何，根据所有这些事实，可以得出结论，局部应用抗体促进骨愈合的能力与rhBMP2相当且可能要优于rhBMP2。

1.1 抗体糖基化改性

有研究表明抗体的糖基化修饰可能会改变抗体结合抗原的能力及Fc端介导的效应，同时糖基化的靶向修饰已经成为生产免疫治疗药物的重要部分。Qingqing Wu等人改变了抗BMP2抗体的唾液酸化，以研究糖基化对抗体介导的骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[19]。体外研究显示：Ab-BMP2免疫复合物能通过结合BMP2受体在体外刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化，但诱导潜能不受体外唾液酸化程度的显著影响。但是在体内发现：过度唾液酸化的Ab-BMP2免疫复合物介导成骨的能力增强，而去唾液酸化组的成骨能力受到抑制。唾液酸化对BMP2-ICs成骨潜能的影响在体内和体外研究中是不一致的，这些相互矛盾的结果表明Ab-BMP2免疫复合物中的BMP2不是决定免疫复合物在体内成骨潜能的唯一部分。这些问题需要进一步研究。

2 抗体介导的骨再生研究模型

上述研究都是是采用大鼠颅顶骨缺损模型，后续有用较大型的兔子的颅骨缺损模型[13]，及犬及非人灵长类动物下颌骨节段连续性缺损模型及胫骨不连续缺损模型进行实验[20,21,22]。在犬的下颌骨节段连续性缺损模型观察12周后，与rhBMP2组相比，单克隆抗体组形成的骨密度更高且人的正常骨密度相当。同样在猕猴的下颌骨及胫骨缺损模型中，也有相似的实验结果。之前的体内研究都是采用原位成骨模型，而在Qingqing Wu等人的研究中采用了异位成骨模型，即在小鼠皮下注射包含抗体及细胞的藻酸盐微球[17]。与原位成骨模型相比，皮下植入的皮内环境减少了内源性骨形成细胞、骨刺激细胞因子、机械转导及其他相关因素的影响。藻酸盐微球被用作载体来传递和固定细胞，Abs或rhBMP2。微球不具有任何骨诱导功能。因此，异位成骨模型在理论上确保了新形成的骨是由于植入的诱导多能干细胞来源的间充质干细胞（iPSC-derived mesenchymal stromal cells,iMSC）（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）、抗BMP2单克隆抗体、rhBMP2或它们的组合效应的成骨潜能。体内研究显示：抗体的促骨再生效果优于直接使用rhBMP2，表现为在rhBMP2诱导下局部形成营养不良性钙化，而抗体组所诱导的新生骨则具有生理性板层状骨小梁结构，TRAP染色抗体组阳性细胞增多，猜测这可能与抗体植入局部出现了支持骨改建的破骨细胞相关。

在所有采用局部使用抗体的动物研究中，未报告任何种类的不良免疫反应，包括血清病、急性过敏反应和细胞因子释放综合征及局部皮肤反应。低浓度局部使用的治疗性单克隆抗体的不良发生率相对较低且安全性较高。在人类临床试验开始之前，需要更严格的毒理学研究及深入研究。

3 抗体介导的骨再生的支架

不同的骨缺损可能需要不同的物理性质的支架材料，其中钛、生物陶瓷，羟基磷灰石和可吸收明胶海绵三者各有优势；ACS和藻酸盐具有很高的生物相容性和生物降解性，适用于不需要抗压强度的骨内缺损[18]；而Ti及生物陶瓷因其具有较强的刚性，适用于在整形外科和颌骨的骨缺损[23]。

Moshaverinia 等人展示了一种骨髓间充质干细胞和抗体的共囊技术结合到RGD偶联藻酸盐水凝胶体系[18]。他们的研究再次证实了抗原抗体复合物和干细胞上的BMP2受体之间的交叉连接，且体内骨量增加明显。而Qingqing Wu等人则通过采用包含iMSCs和抗体的藻酸盐微球体系，结果发现小鼠皮下植入iMSCs +3G7组的位点显示出显著的骨形成和血管形成，且该组的实验效果优于3G7组[17]。因此干细胞和生物分子的同时应用可以为组织工程提供一个改善骨缺损愈合的微环境。