不同年龄段女性液基薄层细胞学、高危型人乳头瘤病毒分型检测及DNA倍体分析在宫颈癌筛查中的作用

杨耀湘，梁颜笑，王小拍

广州市第一人民医院(华南理工大学附属第二医院)病理科，广东广州510180

宫颈癌是女性常见、多发的一种生殖系统恶性肿瘤，近年来，我国宫颈癌的发病率不断上升，是常见的妇科恶性肿瘤[1]，而且发病人群呈现越来越年轻的趋势[2]。防治宫颈癌的关键在于定期进行妇科检查及宫颈癌筛查。宫颈癌筛查现在主要是用液基薄层细胞学（thinprep cytology test,TCT）技术检测，TCT技术的广泛应用使得宫颈病变的检出率提高，但TCT检测宫颈病变的特异性低，易导致漏诊，并且假阳性较高[3]。人乳头瘤病毒（HPV）有组织和宿主特异性，它只能感染人的粘膜上皮细胞和皮肤组织，人又是HPV的唯一宿主[4]。研究表明，宫颈癌的发生99%与HPV的感染有关，但在临床上只检测HPV的特异性比较低，而且HPV阳性并不一定会有宫颈的病变，临床上对HPV阳性存在过度治疗[5-6]。DNA是一种遗传物质，它的结构和功能的改变是细胞恶变的分子基础，而异倍体细胞的出现，是细胞癌变的特征性的指标[7-9]。因此可以通过检测检测细胞中DNA的含量，在其形态学改变之前检测出癌变的细胞或有恶变倾向的细胞而实现癌前病变的早期诊断。该文对广州市第一人民医院2019年1月—2020年10月送检的液基细胞学标本788例进行回顾性分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析广州市第一人民医院的液基细胞学送检标本788份。选取的标本每一份均同时行TCT、HPV和DNA倍体分析联合筛查。每份标本各对应1例患者，年龄19～78岁，平均（40.52±11.32）岁。将所有的标本按照患者年龄和检测结果阴性、阳性进行分组。

1.2 方法

1.2.1 液基细胞学 所有受试检者统一由有经验的妇科医师采取标本。于经期结束3～10 d以窥阴器暴露子宫颈后擦净子宫颈口分泌物，采用TCT专用刷在宫颈口顺时针旋转3圈，停留10 s取材，标本放入TCT专用保存管保存行TCT常规检测。标本震荡混匀后，放入标本转移机中取细胞悬液离心后制成薄层细胞学片，在放入自动染色机中行巴氏染色。宫颈细胞学诊断采用新TBS分类标准（2001年国际癌症协会推荐）[10]，即：①正常范围（WNL），包括未见上皮内病变和炎症；②意义不明的不典型鳞状细胞和腺细胞（ASCUS和AGUS）；③不除外高度鳞状上皮内病变的不典型鳞状细胞（ASCH）；④低度鳞状上皮内病变（LSIL，包含HPV感染）；⑤高度鳞状上皮内病变（HSIL）；⑥鳞癌（SCC）和腺癌（CA）。该文所指的TCT阳性指TCT检查结果至少是意义不明的不典型鳞状细胞和腺细胞（ASCUS和AGUS）以上，②～⑥为阳性诊断，检查分级结果按照不同年龄层依次为≤30岁组、31～55岁组、＞55岁组。

1.2.2 DNA倍体分析 使用TCT标本瓶中的剩余标本，制成一张细胞薄层涂片，DNA倍体分析采用Feuigen染色，D用DNA Index（DI）表示DNA倍体，采用全自动图像分析仪（automatic imaging cytometey,AICM）进行分析，并用标准的细胞片做对照，要求变异系数（coeficientof va riantion,CV）＜5%。每张图片设定扫描8 000个细胞。对每张片上所有细胞核进行扫描测定，出现≥3个细胞、DI＞2.5的异倍体细胞、或1～2个细胞DI＞2.5的异倍体细胞为阳性，未见DNA倍体异常细胞则为阴性[11]。

1.2.3 HPV检测 使用TCT标本瓶中的剩余标本，取1 mL细胞悬液，离心后弃去上清加生理盐水震荡混匀后离心，弃去上清加DNA提取液100℃孵育10 min后离心，取上清加入DNA提取管中扩增DNA后再显色。采用安必平28型人乳头状病毒（HPV）基因分型检测（PCR-反向点杂交法），其中高危型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82(MM4)；中危型26、53、66和低危型6、11、40、42、43、44、54、61、81（cp8304）、83（MM7）。

1.3 统计方法

采用SPSS 20.0统计学软件处理数据，计数资料采用频数或率（%）表示，配对计数资料比较运用配对χ2检验和Kappa一致性检验，Kappa≥0.4表示两者一致性尚可，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3个年龄段3种检测方法诊断结果比较

2.1.1 3个年龄段TCT检查结果比较3个年龄段TCT异常结果差异无统计学意义（χ2＝0.682，P=0.711）。见表1。

2.1.2 3个年龄段DNA倍体分析结果比较3个年龄段的DNA阳性率不相等差异有统计学意义（χ2＝7.388，P=0.022）。31～55岁组的DNA阳性率高于≤30岁组，差异有统计学意义（χ2＝6.701，P=0.01）；≤30岁组与＞55岁组DNA阳性率比较，差异无统计学意义（χ2＝1.405，P=0.236）；31～55岁组与＞55岁组DNA阳性率比较，差异无统计学意义（χ2＝0.503，P=0.478）。见表1。

2.1.3 3个年龄段HPV检测结果比较3个年龄段HPV阳性率对比，差异无统计学意义（χ2＝2.960,P=0.228）。见表1。

表1 3个年龄段3种检测方法诊断结果比较[n（%）]

2.2 液基细胞学检测、高危型人乳头瘤病毒检测、DNA倍体分析结果

788例患者中，TCT检测结果正常720例，异常68例；HPV检测结果阴性622例，阳性166例；DNA倍体分析结果正常731例，异常57例。

2.2.1 TCT检测结果与HPV检测结果的比较788例患者中，TCT检查异常68例（8.63%）；HPV检测阳性结果166例（21.07%），差异有统计学意义（χ2=160.139，Kappa=0.396，P＜0.05），表明两种检测方法一致性较差，HPV的阳性检出率高于TCT，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 TCT结果与HPV结果比较

2.2.2 TCT结果与DNA倍体分析结果比较788例患者中，TCT检查结果异常68例（8.63%），DNA倍体分析结果异常57例（7.23%），差异有统计学意义（χ2=150.884，Kappa=0.436，P＜0.05）。表明两种检测方法一致性较差，两种检测方法的阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 TCT结果与DNA倍体分析结果比较

2.2.3 HPV结果与DNA倍体分析结果比较788例患者中，HPV检测结果阳性166例（21.07%）；DNA倍体分析结果异常57例（7.23%），差异有统计学意义（χ2=60.125，Kappa=0.231，P＜0.05）。表明两种方法一致性较差，HPV阳性检出率高于DNA，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 HPV结果与DNA倍体分析结果比较

3 讨论

目前国内对宫颈癌的筛查中同时检测TCT、HPV和DNA倍体分析的文章较少。该次回顾性分析数据主要是选取同时检测TCT、HPV和DNA这3项检查的标本，在TCT诊断的阳性结果标本中，阳性分布的年龄段主要集中在31～55岁，这与原新丽等[12]报道一致。针对越来越年轻的发病率，将30岁以下的人群单独列一组，结果发现在≤30岁、31～55岁及＞55岁人群中对于TCT和HPV的检测结果相近；但在DNA的结果分析中，31～55岁组的DNA阳性率高于≤30岁组，因此要加强对这一年龄段人群的宫颈癌筛查。结合以往的资料也显示31～55岁人群是高发人群。3种检测方法的比较：HPV的阳性检出率高于TCT阳性检出率（χ2=160.139，Kappa=0.396，P＜0.05）；TCT的 阳 性 率 高 于DNA倍 体 分 析 阳 性 率（χ2=150.884，Kappa=0.436，P＜0.05）；HPV阳性检出率高于DNA倍体分析阳性率（χ2=60.125，Kappa=0.231，P＜0.05）。该次回顾性分析788例标本，HPV阳性166例，总阳性率21.1%，HPV的阳性检出率均高于TCT和DNA，这与熊继永等[13]报道的HPV总阳性率20.29%相符。HPV的检出率偏高，但大部分的HPV感染可自行修复，有时也与人体的抵抗力有关，因此在临床上有时存在着过度治疗的情况，综合上述在临床实践中要综合分析，有条件地最好同时进行这3个检测方法，可以减少漏诊率同时也可以避免过度诊断、过度治疗。

相比较于传统的涂片法，涂片细胞厚，特别是当黏液和血液比较多的时候涂片更加难以诊断。随着TCT技术的发展，该院用的是安必平的试剂和仪器，用细胞处理液处理保存瓶中的试剂，去除了很大一部分的黏液、血液和其他杂质，留下宫颈细胞进行沉降、制片、染色及封片，做出来的片子细胞分布均匀，染色鲜亮，比较好诊断。其结果受主观诊断水平影响较大，也跟医生的取材质量有关系，而且重复性较差，因此TCT检测在宫颈病变的早期诊断中存在一定的漏诊率和误诊率[14]。

全自动细胞DNA倍体定量分析技术，是指宫颈细胞学从以前形态学的描述向细胞定量分析的描述[15]。DNA倍体在国际上已经是公认的肿瘤细胞形成的一个生物标记[16]，异倍体细胞图像分析是在宫颈癌的诊断上判断恶性程度，异倍体细胞数量越多，恶性程度就越高。近年来DNA倍体定量分析技术被许多医院及临床检测机构应用于宫颈癌及癌前病变的检测[17]。异倍体细胞的出现直接表明检测细胞在结构上及染色体数目上均发生了改变，是细胞恶变的早期表现之一。DNA异倍体的检测主要是检测DNA，将保存瓶中的细胞处理后，制片，通过固定、酸化、染色和封片，制好片后在设定好的扫描仪中扫描片子，该研究设定扫描8 000个细胞，从扫描的细胞中清除重叠的细胞还有一些杂质细胞，将系统分析出来的DI＞2.5的细胞仔细分析，辨别。但是临床操作上要注意细胞再前处理中一定要混匀，因为是手工制片，在制片的过程中细胞要混匀注意细胞分散液要适量，这样做出的片子才会细胞分散均匀，重叠少。

HPV是指的人乳头瘤病毒，在潮湿温暖的环境中较容易滋生，HPV病毒分为高危型、中危型和低危型。持续的高危型感染会导致宫颈癌的发病率增高。宫颈癌发生一定伴随着HPV的感染，但从HPV感染到发展到宫颈癌一般需要7~10年[18]。大多数HPV感染为暂时性的可自行恢复。2012年美国国立综合癌症网络公布的《宫颈癌筛查临床试验指南》将HPV联合TCT检测作为30～65岁女性宫颈癌的主要初筛方法[19]。临床将早发现、早诊断和早治疗作为预防和检测宫颈癌的方法，这样降低宫颈癌的发病率和病死率[20]。HPV在检测中特别是要注意实验室污染的问题，特别是在第一步混匀吸取样本和最后开盖点样时，例如该科室使用的安必平的试剂，最后需要将PCR的产物开盖点样，这一步要特别注意气溶胶的产生，防止实验室的污染。

综上所述，31~55岁人群应重视宫颈癌的筛查，HPV的阳性率比TCT及DNA倍体分析的高，临床需结合TCT及DNA倍体分析的结果综合考虑，避免过度治疗。但该次回顾性研究由于缺乏病理诊断的结果，只是将这3种检测方法自相比较，在今后的研究中将积累更多的临床病例与病理诊断结果，比较每种方法的灵敏性，各自的特异性和病理符合率。