microRNA-125b通过调控Nrf2/Keap1信号通路影响光感受器细胞氧化应激

刘金霞，王钰池，郭卓，赵江月，孔珺，秦宇

（中国医科大学附属第四医院眼科，中国医科大学眼科医院，辽宁省晶状体学重点实验室，沈阳 110005）

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是老年人群不可逆转性盲的主要原因之一［1］。AMD分为干性和湿性2种类型，其中，干性AMD占比较多，目前尚无有效治疗手段［2-3］。干性AMD的病理改变以光感受器细胞变性为主［4］。视网膜氧化损伤已被确定为干性AMD的主要致病因素之一，光感受器细胞受到各种来源的氧化应激刺激，导致视网膜退行性变，严重影响视力［5］。

核因子E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是机体发挥抗氧化应激反应的重要转录因子。基础状态下，Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）与Nrf2在细胞质中结合，引起Nrf2降解；氧化应激时，Nrf2与Keap1解离，移位入核，与下游基因血红素单加氧酶（heme oxygenase-1，HO-1）结合，发挥抗氧化作用［6-7］。因此，通过激活Nrf2/Keap1信号通路，可增加细胞抗氧化反应能力，减轻细胞氧化损伤［8］。微RNA（microRNA，miRNA）可通过内源性RNA干扰机制抑制多种靶基因的表达，调节各种细胞功能［9］。已有研究［10］证明，多种miRNAs可通过调控Nrf2影响AMD发 病，包 括miR-144［11］、miR-141［12］、miR-626［13］等。但光感受器细胞中miRNAs对Nrf2的调控机制尚未完全明确。本研究通过细胞实验，研究在干性AMD中miR-125b通过Nrf2/Keap1信号通路对光感受器细胞氧化应激反应的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠视锥细胞系661W细胞由美国休斯顿大学Muayyad R.AL-UBAIDI教授赠予。DMEM培养液、青链霉素混合液、胰蛋白酶、PBS（中国江苏凯基生物公司），3%过氧化氢（H2O2）溶液、DMSO（美国SIGMA公司），胎牛血清（澳大利亚AusGeneX公司），RNAiso Plus、LipofectamineTMRNAiMAX、OPTI-MEM（美国Invitrogen公司），PrimerScript RT reagent Kit（日本TaKaRa公司）、TB Green premix Ex Taq Ⅱ（日本TaKaRa公司），增强型CCK-8试剂盒（美国Apexbio公司），mRNA引物（中国上海生工生物工程公司），miR-125b与RNU6B的RT引物、PCR引物、miR-125b模拟物、模拟物对照、抑制物、抑制物对照（中国广州锐博公司），SDS-PAGE胶（中国碧云天生物技术有限公司），PCR逆转录仪（美国BIO-RAD公司）。RT-PCR仪（美国AppliedBiosystem公司），荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：用含5%胎牛血清和1%青链霉素混合液的 DMEM 培养基，于37 ℃、5% CO2的培养箱中，培养 661W细胞。待细胞生长至80%～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶进行消化、传代，用于后续实验。

1.2.2 CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性：取对数生长期661W细胞消化并离心后，用含5%胎牛血清DMEM 培养基重悬细胞，制成细胞悬液，以每孔2×104细胞接种于96孔板中。用正常培养细胞组作为对照组，用培养基不含细胞组作为空白对照组。用不同浓度H2O2（400，600，800，1 000 μmol/L）处理细胞6 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培养箱中孵育1 h，用酶标仪检测450 nm 波长处的吸光度值（A）。细胞增殖活性=（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。

1.2.3 细胞转染：将661W细胞培养至30%～50%融合。用LipofectamineTMRNAiMAX和无血清Opti-MEM培养基将miR-125b模拟物、模拟物对照（100 nmol/L）和miR-125b 抑制物、抑制物对照（30 nmol/L）分别转染至661W细胞，在37 ℃培养箱中继续培养48 h后，进行后续实验。

1.2.4 实时荧光定量PCR（qPCR）检测：用TRIzol提取各组细胞的总RNA，用反转录试剂盒Primer Script RT reagent Kit反转录为cDNA，qPCR试剂盒TB Green premix Ex Taq Ⅱ检测miR-125b与Keap1/Nrf2/HO-1mRNA的表达水平，RNU6B为miR-125b内参对照，GAPDH为Keap1/Nrf2/HO-1内参对照。所有操作均严格遵循说明书。引物序列见表1。

表1 实时PCR引物序列（5’-3’）Tab.1 Primers for qPCR assay（5’-3’）

1.2.5 Western blotting检测：利用RIPA细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。95 ℃水浴10 min变性，蛋白上样行SDS-PAGE凝胶电泳。转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。用Keap1抗体（1 ∶5 000）4 ℃过夜孵育，GAPDH作为内参对照。将孵育过一抗的PVDF膜用TBST洗3次，10 min/次，用山羊抗兔二抗（1 ∶5 000）室温孵育2 h，TBST 洗膜3次，10 min/次。ECL 发光显影，采用Image J软件分析条带灰度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，用Graph-Pad Prism 8作统计图。所有结果均以表示；采用独立样本t检验和单因素方差分析对结果进行显著性比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 661W细胞氧化应激模型中miR-125b与Keap1/Nrf2/HO-1 mRNA的表达

分别利用400、600、800、1 000 μmol/L H2O2处理661W细胞6 h，用CCK-8试剂盒检测细胞活性变化。结果显示，当H2O2浓度为800 μmol/L时，细胞活性降低至50%左右，故后续试验选用800 μmol/L H2O2构建细胞氧化应激模型。qPCR结果显示，与对照组相比，随着H2O2浓度逐渐增加，miR-125b表达逐渐降低。661W细胞氧化应激模型中，Nrf2及其下游基因HO-1mRNA表达升高，Keap1mRNA表达降低，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见图1。说明661W细胞受到氧化应激刺激后，miR-125b表达降低，Nrf2及其下游基因HO-1表达水平升高，Keap1表达水平降低。

图1 661W细胞氧化应激模型中miR-125b及Keap1/Nrf2/HO-1 mRNA的表达Fig.1 Expression of miR-125b and Keap1/Nrf2/HO-1 mRNA in oxidative stress model of 661W cells

2.2 miR-125b调控661W细胞氧化应激模型中Keap1/Nrf2/HO-1 mRNA的表达

661W细胞氧化应激模型中，转染miR-125b 模拟物组miR-125b、Nrf2和HO-1mRNA的表达显著高于转染模拟物对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；转染miR-125b抑制物组miR-125b、Nrf2和HO-1mRNA的表达水平显著低于转染抑制物对照组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；转染miR-125b 模拟物组和转染miR-125b抑制物组分别与转染模拟物对照组和转染抑制物对照组比较，Keap1表达在mRNA水平无明显变化，见图2。说明miR-125b可能通过调控Nrf2及HO-1mRNA的表达以增强661W细胞抗氧化应激能力，但对Keap1mRNA的表达无明显影响。

图2 调控miR-125b对661W细胞氧化应激模型中Keap1/Nrf2/HO-1 mRNA表达的影响Fig.2 Up-or down-regulating miR-125b affects expression of Keap1/Nrf2/HO-1 mRNA

2.3 miR-125b通过在转录后水平调控Keap1蛋白表达调控Nrf2信号通路

如前所述，661W细胞氧化应激模型中，miR-125b 对Keap1mRNA的表达无明显影响，Western blotting结果显示，转染miR-125b 模拟物组Keap1的蛋白表达水平显著低于转染模拟物对照组；转染miR-125b抑制物组Keap1的蛋白表达水平显著高于转染抑制物对照组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见图3。说明miR-125b可能通过在转录后水平调控Keap1蛋白的表达，调控Nrf2及HO-1的表达，从而促进661W细胞抗氧化应激能力。

图3 调控miR-125b对Keap1蛋白表达水平的影响Fig.3 Up-or down-regulating miR-125b affects expression of Keap1 protein

3 讨论

干性AMD早期病变主要表现为玻璃膜疣形成，玻璃膜疣数目和大小的增加显著增加疾病进展的风险；干性AMD的晚期病变地图状萎缩的形成主要由光感受器和视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞死亡引起［14］。视网膜由RPE和神经视网膜组成，其生理结构和高代谢活性对视觉功能至关重要，尤其容易受到氧化损伤。视网膜氧化损伤是包括AMD在内的视网膜退行性疾病的主要致病因素之一［15］。

Nrf2信号通路是体内主要的抗氧化信号通路之一，关于miRNAs对该通路的调控目前国内外尚未见明确报道。LAI等［16］发现，虾青素能够通过PI3K/Akt/Nrf2通路减少661W细胞中活性氧的产生，并抑制细胞凋亡。CARLOTTA等［17］发现2-乙酰基-5-四羟基丁基咪唑能够通过激活Nrf2/HO-1通路减轻H2O2诱导的661W细胞的氧化应激反应和细胞凋亡。此外，Nrf2激动剂RS9能够减轻光诱导的661W细胞损伤［18］。miR-125b与细胞增殖、迁移、凋亡和分化等密切相关［19］。YANG等［20］发现，miR-125b通过Keap1/Nrf2通路减轻肝损伤，并利用双荧光素酶报告基因系统验证了miR-125b与Keap1之间存在直接的连接位点，提示了miR-125b对Keap1/Nrf2直接的调控作用。

本研究利用H2O2构建光感受器细胞氧化应激模型，研究在干性AMD发病过程中miR-125b对抗氧化信号通路Keap1/Nrf2/HO-1可能的调控机制。结果显示，与对照组相比，miR-125b在光感受器细胞氧化应激模型中表达显著降低，Nrf2及其下游基因HO-1表达增加，Keap1表达降低，表明当光感受器细胞受到氧化刺激以后，Keap1表达减少，对Nrf2的锚定作用降低，因此Nrf2表达增加且移位入核发挥抗氧化作用。转染miR-125b 模拟物后，Nrf2/HO-1表达增加，Keap1表达在mRNA水平无明显变化，在蛋白水平显著降低，提示miR-125b可能在转录后水平调控Keap1蛋白的表达，进而促进Nrf2/HO-1的表达，从而增强光感受器细胞的抗氧化能力，转染miR-125b抑制物的结果也证明了这一点。然而，miR-125b与Keap1之间的直接靶向关系还需将来进一步验证。

综上所述，miR-125b可促进光感受器细胞的抗氧化应激能力，该作用可能通过调控Keap1/Nrf2/HO-1信号通路实现。本研究利用细胞转染的方法调控miR-125b在光感受器细胞中的表达，初步论证了miR-125b在干性AMD发病过程中的调控作用，提示miR-125b可能成为干性AMD治疗的新靶点。