物理诱变技术在药用真菌育种中的应用现状与展望
2021-11-27刘超雄冯婷婷李亚娇慕宗杰孙国琴郭九峰于传宗王海燕刘利
刘超雄,冯婷婷,李亚娇,慕宗杰,孙国琴,郭九峰,于传宗,王海燕,刘利
(1.内蒙古大学物理科学与技术学院,内蒙古呼和浩特010021;2.内蒙古自治区农牧业科学院蔬菜研究所,内蒙古呼和浩特010031;3.内蒙古自治区农牧业科学院农牧业经济与信息研究所,内蒙古呼和浩特010031)
药用真菌是具有疾病治疗、保健养生功能的一类大型真菌[1],我国药用真菌种类十分丰富,且分布广泛,也是最早利用真菌作为药材治疗疾病的国家[2]。中医四大经典著作之一的《神农本草经》中记载的药用真菌就有木耳、茯苓、猪苓等10余种[3];明朝著名医药学家李时珍编写的《本草纲目》增添了桑黄、竹荪、马勃等40余种药用真菌;清朝药学家汪昂所著的《本草备要》首次记载了冬虫夏草,并阐述具有的药用价值[4]。随着科学研究不断深入,药用真菌在治疗疾病领域展现越来越明显的作用,具有很大的开发前景。
随着社会经济的快速发展,对药用真菌的需求量快速增加,野生药用真菌资源的数量已经远远不能满足疾病治疗和科学研究的需求,因此,人工培养出数量多、质量高、无污染的药用真菌已成为解决问题的首选,药用真菌的培养与大规模生产面临机遇与挑战,而诱变育种能够在较短的时间内改变药用真菌的遗传特性,能够获得满足条件的理想植株,利用物理诱变技术后变异的药用真菌具有培养周期短、价格低廉、对环境的适应能力强等优点,已经广泛应用[5]。
1 物理诱变技术在药用真菌研究中的应用
目前,人工栽培的药(食)用真菌品种都是从野生菌种驯化而来,这些驯化方法包括了诱变育种、杂交育种等,药用真菌在没有人工干预的自然条件下也会发生突变,但是突变效率极低、有利于质量提升、产量提高的高品质突变菌株屈指可数,相关研究较少[6-7],而且采用基因工程等技术对药(食)用真菌育种尚存在很大难度,因此物理诱变恰好弥补了这种不足,传统的物理诱变具有高效、操作简单等优点,非常适用于药用真菌的诱变育种[8]。
1.1 紫外线诱变技术
紫外线诱变技术是人类最早使用的诱变育种技术,核酸紫外线最大的吸收峰在260 nm,正因如此,波长为260 nm的紫外线辐射诱变最有效[9]。当紫外线被吸收后,DNA分子会引起突变甚至可以使正常的DNA分子产生缺失、颠换、转换、移码突变等,从而对DNA分子造成不可逆转的改变[10]。刘瑛颖[11]利用紫外线照射猪苓菌丝后,处理过的菌丝生长速率有了不同程度的提高或降低,发现处理7 min产生的变异菌株U1-7生长速率最快;刘敏[12]利用紫外线照射杏鲍菇原生质体,再生菌落开始减少,发现诱变后的再生率变低,且多数为负诱变,经过多次重复试验才得到几株正诱变菌株。
1.2 电离辐射诱变技术
早在1927年,美国遗传学家MULLER发现X射线可以引起果蝇的遗传物质发生可遗传的变异[13],获得了1946年诺贝尔生理或医学奖,以表彰他对遗传学做出的贡献[14]。
利用X射线辐射的方法能够使电离辐射直接或者间接地作用于被诱变真菌的DNA双螺旋结构,产生的电离作用可以直接引起糖-磷酸键、碱基甚至脱氧核糖的化学键断裂[15],电离辐射更容易打断DNA双链或者单链结构,从而引起染色体缺失、断裂、重复等突变[16]。由于电离辐射诱变具有突变效率高、操作简便等优点,常被用于药用真菌菌种的选育。张变英[17]通过对不同剂量的60Co-γ射线辐照黑曲霉和白腐真菌的孢子悬浊液研究,发现辐照剂量和残存细菌呈明显的负线性相关关系。
1.3 激光诱变技术
激光诱变是20世纪60年代兴起的一项新技术,已经广泛应用于农作物诱变育种,促进了农作物品种的创新和改良[18],由于激光诱变具有性状稳定,诱变效率高且无污染等优点[19],常用于药用真菌菌种选育,最常用的激光器主要是CO2、He-Ne、N2、YAG等[20]。
殷凤鸣等[21]利用CO2、He-Ne和N2激光器对白僵菌孢子进行照射,得到激光处理的白僵菌孢子优良特性保持的代数比未经处理的多2~6代,在同等条件下生产用激光处理的菌株产孢量比未经处理的高出2~4倍,经激光处理筛选出来的白僵菌,生长速度快,易形成生长优势,抗污染的能力强。祝子坪等[22]利用He-Ne激光诱变桑黄菌原生质体,发现照射时间为30 min时,随着能量密度的降低,桑黄菌原生质体存活率逐渐升高,当能量密度降低到一定值时,激光对原生质体失去致死作用,表现出阈值效应。
1.4 离子束诱变
离子束技术是20世纪80年代由中国科学院等离子研究所开发的一项新兴技术,被广泛应用于植物诱变领域[23],离子束诱变的具体过程是将一束具有能量且质量数≤4的带电粒子注入生物体细胞[24],带电粒子注入细胞后,由于质量沉积、电荷交换或者是动量作用等引起不同的生物学效应,比如染色体变异、DNA结构改变[25]。
离子束诱变方法已经应用于药用真菌的诱变育种[26],在菌种选育中发挥了重要作用。以离子束为代表的低能电离辐射诱变与以X、γ射线为代表的高能辐射诱变相比,在相同剂量辐照下,离子束诱变育种具有更高的生物学效应[27],离子束诱变具有很多优点,比如变异率高、变异谱宽、变异速度快、技术稳定可靠[28],可在短时间内获得稳定的药用真菌品系,相对生物学效应大,损伤可修复性小[29]。李文等[30]在通过离子束诱变源修饰蛹虫草菌株后,筛选得到了虫草素含量较高的菌株,最多达(11.924±0.063)mg/g,比对照提高近30%,王陶等[31]将低能N+注入蛹虫草菌株,得到了在不同氧化锗浓度下,注入离子束的生物量均比原始菌株要高。
1.5 超声波诱变技术
超声波是一种频率高于20 kHz的声波,与其他频率相比,超声波在传播过程中具有方向性好、穿透力强、传播距离远等优点,已在生产生活中被广泛应用。
超声波在诱变育种方面也有重要应用价值,当超声波频率与分子的固有频率相同时,就能发生共振,分子吸收的超声波能量值达到最大,会使分子中的原子发生激烈振动,这种振动可能会使分子链发生断裂,从而引起突变[32]。张帅等[33]利用超声波诱变猴头菇,使菌丝体中猴头菇多糖含量与原始菌株分别提高了1.2%,子实体提高2.3%。
1.6 等离子体诱变技术
常压室温等离子体(ARTP)诱变技术作为一种新型的诱变技术,相比传统的诱变手段,ARTP诱变技术具有操作简单、安全性高、无污染等优点[34],近年来广泛应用于药用真菌的诱变育种领域。该技术的诱变原理是ATRP诱变技术采用He作为工作气体,在大气压下,He可以产生高浓度活性粒子的等离子体射流[35],释放出来的活性粒子能够使DNA分子链发生断裂,导致DNA损伤,此时细胞启动紧急修复机制,从而引起微生物的突变[36]。张赫男等[37]利用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术,选育高产黄酮的桑黄菌株,得到3株优势菌株,与出发菌株相比,其胞内的黄酮产量分别提高了86.7%、20%和60%。马玉涵[38]利用常压室温等离子体(ARTP)诱变灵芝原生质体,诱变后的菌丝球大小、形态、颜色、生物量、生长速度等与未进行诱变的菌丝体有明显差异,并且多糖高产菌株较出发菌株含糖量提高了25.6%,多糖低菌株多糖含量相当于出发菌株的62.4%。
1.7 中子诱变技术
中子按能量大小可以分为超快中子、快中子、中能中子、慢中子、热中子5种,利用中子进行诱变育种使用较多的一般为热中子和快中子[39]。快中子是在核反应中,未经过减速剂减速的中子,这种中子可以使碱基互补配对的A-T、C-G之间的氢键断裂;在一个或两个DNA链中,糖和磷酸基之间断裂;在同一个DNA上相邻的两个胸腺嘧啶之间形成二聚体,从而导致DNA的结构发生改变[40]。郑丽丽等[41]利用0.75Gy剂量的快中子辐照诱变黑曲霉菌株,得到了突变菌株酶活力均有不同程度的提高,其中Fn5-2株木聚糖酶活为134.77 U/mL,试验后测得Fn5-2株木聚糖酶活的含量是出发菌株的1.72倍,说明对黑曲霉进行快中子辐照能显著提高其产木聚糖酶的能力。
1.8 太空诱变技术
太空诱变又叫太空育种,是指将植物种子利用返回式卫星搭载、高空气球搭载等方法产生诱变,再返回地面的一种作物育种新技术[42],返回式卫星搭载所处的宇宙空间是高真空、超洁净、微重力,存在不同能量的宇宙射线的特殊环境[43],这些条件对于生物材料来说,难以在地面产生诱变作用,研究表明,经过空间诱变的后代不仅变异率高,而且变异幅度大,有害突变少,有益突变多,培育后的产量和质量都有明显提高[44]。
张隽[45]利用搭载神舟七号飞船,经太空诱变,标号为EFC-03(太空)的喜树内生真菌,和未经过太空诱变的对照菌株-喜树内生真菌,标号为EFC-03(地),两株菌株在相同情况下连续培养3代,第1代太空菌株在第2天生长出来的菌落数量明显多于地面对照菌株,而且太空菌株分裂出的孢子数量远大于地面对照组的菌株。但是观察第2代、第3代菌株的生长发育情况,接受了搭载卫星进行太空诱变的菌株在生长速度上已经没有了第1代的优势,第2代和第3代不论是太空育种菌株还是地面对照菌株在培养后第2天生长出来的菌落数量没有明显差别,从而得到了第1代太空菌株具备了较快的生长优势,但这种优势不具备遗传能力,到第2代之后,这种生长优势消失[45]。
1.9 复合诱变技术
复合诱变是指采用两种或者两种以上的诱变方法共同作用于需要诱变的菌体,使诱发菌体产生突变,从而改变菌体的遗传物质,由于不同的物理诱变方法作用机理不同,且不同的诱变方法具有各自特异作用位点,有些物理诱变单独作用于被诱变对象时效果不甚理想,但是与其他物理诱变方法相结合,则能起到很好的效果[46]。因此,利用复合诱变法有利于拓展突变谱、增加突变频率、提高正突变率[47]。
赵南等[48]利用紫外线照射和常压室温等离子体ARTP辐射相结合进行复合诱变蛹虫草,结果表明,经过复合诱变的蛹虫草菌株虫草素产量高达5.95 g/L,比出发菌株2.43 g/L提高了146.1%,经过10次传代,蛹虫草菌体依然保持比较高的活性。李亚洁等[49]利用60Co-γ射线与常压室温等离子体ARTP辐射相结合,以复合诱变的方法对蛹虫草菌株进行处理,试验结果表明,经复合诱变的3株菌株,其子实体与出发菌株相比,产量分别提高了32.27%、36.00%和33.87%,通过对突变菌株的遗传稳定性和规模生产化测试,该菌株具有遗传稳定的特征,且子实体产量明显高于现行生产菌株,增幅可达17.3%,这表明利用60Co-γ射线与ARTP辐射相结合复合诱变蛹虫草,可以获得高产子实体菌株。
2 药用真菌物理诱变育种过程与方法
由于药用真菌种类繁多、结构复杂,应根据药用真菌生长特性选择最合适的诱变方法,采用小规模预实验和大规模筛选相结合的方式进行育种,有利于提高突变菌株的筛选效率,从而得到理想的菌株,以下从诱变对象、诱变预实验、菌株筛选和鉴定4个方面综述物理诱变药用真菌的选育过程。
2.1 诱变对象
在选择出发菌株的过程中,往往选用未经诱变,具有良好诱变效果的菌株,这样有利于提高菌株的诱变质量和诱变效果。药用真菌诱变对象选用单细胞的原生质体,这样可以使其均匀接触诱变剂,避免出现不纯的菌落[50]。
药用真菌菌丝原生质体为诱变对象,具有操作简单、容易筛选、生长周期短等优点,诱变育种原生质体能够改良已经退化的菌种,并产生不同性状的菌株,对于一些已经具有耐药性的菌株或者具有营养缺陷的菌株,展开原生质体融合育种和遗传学工作,是非常具有研究价值的[51]。
孙婷婷等[52]利用桑黄DL101的菌丝为材料,加入0.5%崩溃酶+2.0%溶壁酶,酶解温度30℃,酶解3 h,此时原生质体得率达到最高,为1.49×107个/mL,此外用0.6 mol/L的MgSO4作为再生渗透压稳定剂时桑黄原生质体的再生率最高,可达到0.67%。
2.2 诱变预试验
不同种类的药用真菌对不同的物理诱变的敏感性可能存在差异,在进行诱变育种前应预实验,分析诱变剂量对真菌的致死率,选择合适的剂量,再进行正式试验。
周礼红等[53]利用紫外线诱变蛹虫草原生质体,分别使用紫外线设备在黑暗的环境中、红灯下操作,按照0、10、30、50、70、90、110、140、170、200、230、300 s的时间照射蛹虫草原生质体,取每一次照射的原生质体液体1 mL,并进行适当稀释,将稀释后的液体取0.1 mL涂布再生平板,将涂布原生质体的平板放在25℃的黑暗条件下培养5~7 d,将实验得到的数据绘制成紫外线诱变致死率曲线,最后经过筛选,得到了紫外线诱变致死率在85%左右,即紫外线照射时间为170 s。
2.3 诱变后药用真菌菌种的筛选
诱变后的药用菌种可以根据菌丝的生长状况进行初步筛选,主要筛选指标包括菌丝的颜色、密度、长势、长速等[54],这些筛选指标可通过肉眼辨别,在早期初步筛选发挥了重要的作用,接下来可以利用试验的手段进行筛选。曲鸿雁等[55]首先烘干并研磨成粉末的冬虫夏草与蛹虫草融合株的菌丝体,再采用微波提取法和高碘酸钾比色法测定虫草酸产量,紫外分光光度法测定虫草素产量,并与亲本进行比较,从而获得优势突变菌株。
2.4 物理诱变后菌株的鉴定
药用真菌需要经过多轮筛选才能获得几株差异显著的菌株,这些菌种还需要鉴定。药用真菌的菌株鉴定使用拮抗试验[56]、功能成分含量[57]、同工酶分析[58]、基因组重测序[59]、蛋白质组测序[60]等方法。
2.4.1 拮抗试验拮抗试验是鉴定药用真菌亲缘关系的1种试验[61],是初步鉴定新菌株的方法。杨珊等[62]使用常压室温等离子(ARTP)技术诱变猴头菇原生质体,将进行诱变后的菌种进行生物学鉴定,由于拮抗反应是遗传特征不同的重要表现,不同菌株间的拮抗反应有所不同,不同菌株的亲缘关系越远,株系间的拮抗越强,发现诱变后的菌株与出发菌株产生了明显的拮抗线,表明两株菌生长相互抑制,且诱变后的菌株与出发菌株相比有明显的生长优势,这表明常压室温等离子体(ARTP)辐照猴头菌株原生质体可能使其遗传物质发生改变。
2.4.2 功能成分含量分析根据诱变目标,选择药用真菌的某些指标作为分析指标,分析诱变后的菌株与出发菌株是否存在差异,例如张帅等[63]利用紫外线诱变技术选育高产灵芝菌丝体多糖的灵芝菌株,将灵芝菌丝多糖作为分析指标,以判断诱变前后的菌株灵芝菌丝体多糖含量是否发生变化。
2.4.3 同工酶技术同工酶是指来源相同,具有相同催化作用但是分子结构不同的酶蛋白分子。同工酶普遍存在于高等植物中。大多数同工酶受不同因素的调节,常表现出不同的生理功能,在植物栽培、诱变育种方面有着广泛的应用[64]。刘娜等[65]利用同工酶技术分析香菇杂交菌株脂酶的同工酶分析,经过实验得到了杂交后代和亲本既有共同酶带,也有特征酶带,通过实验可认为供试的10个杂交后代与亲本有差异;对931(59)和野生香菇(xy2)为亲本的杂交群体进行聚类分析,结果表明,两个亲本菌株的遗传距离有一定差异,进一步分析后得到在相异系数为0.6时可以将杂交群体分为3类,以168(ztd)和野生香菇(xy2)为亲本与杂交后代的聚类分析,野生菌株(xy2)相比其他种类的菌株亲缘关系较远,所以可以单独分为10类,而杂交后的几个菌株的遗传距离较近。聚类分析结果也初步说明了香菇杂交亲本与后代的关系,并为进一步培养提供了可靠的理论依据。
3 展望
近年来,随着人们对药用真菌需求持续增长,药用真菌开发利用已经成为21世纪最具发展潜力的新兴产业之一,药用真菌相比其他药物,具有功效显著、价格低廉、无农药使用等优点,越来越成为人们治疗疾病的新选择,人类通过对药用真菌进一步的拓展研究,发现某些药用真菌具有明显的肿瘤抑制效果,有些药用真菌的代谢产物、多糖类、萜类、蛋白质类等对肿瘤均有良好的抑制作用,在传统手术治疗、放射性治疗、化学药物治疗后,食用具有抗肿瘤作用的药用真菌可以减少副作用,这些真菌中的多糖和蛋白多糖体是起到抑制肿瘤作用的主要成分,药用真菌不仅可以抑制肿瘤的生长,还具有预防肿瘤产生、转移的功效,同时还能使机体产生抗体,提高免疫力,从而发挥抗癌的功效。
物理诱变对药用真菌的影响巨大,且物理诱变育种技术已经发展到了一个比较成熟稳定的阶段,但是物理诱变选育出来的药用真菌新品种屈指可数,在实际生产中也很少大规模推广。有些经过物理诱变的药用真菌菌株在经过多次培养后,药用真菌菌株后代恢复了原有性状,与出发菌株无明显差别,产生的优良性状并没有遗传下去,这就为从事真菌诱变育种的科技工作者带来了全新的挑战,如何使诱变后的具有优良性状的菌株可以稳定遗传下去,是今后需要解决的重要技术问题。此外,物理诱变药用真菌育种具有很强的随机性,诱变后产生优良性状的菌株,只能通过浅层次实验进行判断,真菌细胞内部发生了哪些变化,究竟是什么原因导致了某些指标发生变化,比如染色体是否发生断裂、易位或丢失,或者DNA碱基排列顺序是否变化等,都是需要研究的问题。
物理诱变能够有效对药用真菌产生诱变,创造新的品种,能为药用真菌的选育提供丰富的材料,物理诱变被证明有广阔的应用前景,许多从事相关研究的科技工作者在开展物理诱变育种方面做出了不懈努力,积极探索开发物理诱变新技术。物理诱变方法已经广泛应用于食品、环境、医学等领域,利用物理诱变造福人类,一直是广大科学工作者努力的方向,也是造福人类的一剂良方。