番茄抗枯萎病分子机制研究进展

成 璐，欧阳寿强

（扬州大学园艺与植物保护学院，江苏 扬州 225009)

番茄是全球最主要的蔬菜作物之一，其营养丰富，栽培技术成熟，在我国被广泛种植。番茄枯萎病是由土传真菌病原物尖孢镰刀菌番茄专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici，Fol）通过侵染番茄根系引起的番茄病害。Fol病原菌致病力强且发病范围广泛，被研究者列为世界上第3大土传病原真菌，所导致的番茄枯萎病给番茄生产造成了巨大损失[1-2]。尖孢镰刀菌的寄主范围非常广泛，可引起茄科、瓜类、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。在现代农业生产中，设施蔬菜瓜果类作物由于在相对封闭的环境下生长，特殊的小气候虽有利于农作物生长，但也促进了各种病虫害的滋生，加之长年连作，土壤中病原菌的数量不断增加，导致设施栽培蔬菜的枯萎病发生越来越严重。由尖孢镰刀菌番茄专化型病原菌引起的枯萎病是番茄生产上最严重的真菌病害之一，研究番茄—尖孢镰刀菌互作的分子机制对番茄农业生产具有重要的理论意义。本文根据国内外番茄抗枯萎病的病原及其致病机制、寄主抗病机制进行了总结概述，以期为番茄抗枯萎病分子育种及绿色防控提供参考和借鉴。

1 番茄枯萎病病原研究进展

枯萎病病原菌有细菌性病原菌和真菌性病原菌2种，本文主要阐述的番茄枯萎病病原菌为真菌性病原菌[3]。尖孢镰刀菌为真菌性病原，属半知菌类（Fungi Imperfecti）、梗孢目（Moniliales）、痤孢科（Tuberculariaceae）、镰刀菌属（Fusarium）[4]。早在1940年，研究人员就发现并提出番茄枯萎病真菌病原菌存在生理小种的理论[5]，番茄枯萎病病原菌主要包括2个生理小种：1号生理小种和2号生理小种，属近等位基因系品种，广泛分布于美国大部分地区以及以色列、日本、加拿大、澳大利亚等地，而我国主要以1号生理小种为主[6-8]。番茄枯萎病主要是由尖孢镰刀菌番茄专化型病原菌引起的，通常尖孢镰刀菌只能在一种植物宿主上引起枯萎病[9]，其孢子形态主要有3种：小型分生孢子、大型分生孢子和厚垣分生孢子[10]。枯萎病病原菌主要以菌丝体、分生孢子、厚垣孢子的形式在农具、种子及土壤中传播。侵染时，孢子萌发管或菌丝体通过根部进入植物体内，在根皮层细胞间侵染至木质部，再通过木质部导管蔓延至茎秆及顶部，最终导致植株维管堵塞、叶片气孔关闭、叶片萎蔫，甚至整株死亡[11]。

2 尖孢镰刀菌致病机制

尖孢镰刀菌成功侵入寄主植物需要经过一系列过程：首先通过根部侵入寄主植物，在此过程中会分泌毒素、细胞壁降解酶等物质，降低寄主防御机制并在寄主体内定植，寄主植物感知信号，叶片由下而上变黄，最后致使植株萎蔫死亡[12]。

2.1 尖孢镰刀菌定植机制

2.1.1 尖孢镰刀菌分泌致病毒素

毒素是植物病原真菌重要的致病因子，尖孢镰刀菌侵入寄主后会分泌相关毒素物质，如镰刀菌属真菌（Fusarium）分泌的非专化型毒素镰刀菌酸（5-丁基-2-吡啶甲酸，Fusaric acid，FA）能增加寄主细胞膜透性，降低粒体活性氧含量，阻止ATP合成，损伤植物根系，影响种子萌发，最终导致寄主植物死亡[13-14]，但低含量毒素能诱导植物合成植保素[15]。在尖孢镰刀菌番茄专化型中发现了编码F-box毒素蛋白基因FRP1，它的缺失使Fol的毒力下降，侵入能力也受到一定影响[16]。

2.1.2 细胞壁降解酶破坏植物细胞壁

在病原菌侵染寄主植物致病的过程中，病原菌可通过分泌一系列细胞壁降解酶，侵入寄主植物的细胞壁，侵染植物使其发病。镰刀菌分泌的细胞壁降解酶主要包括果胶酶（Pectic enzyme）、纤维素酶（Cellulase）、半纤维素酶（Hemi cellulase）、角质酶（Cutinase）和其他酶类，如蛋白酶（Protease）等[17]。一般情况下，植物镰刀菌的单个细胞壁降解酶基因缺失对镰刀菌毒力没有太大影响[18-19]，其原因在于镰刀菌可能通过调节其他细胞壁降解酶的表达来弥补这个基因功能；若同时敲除2个或多个编码细胞壁降解酶的基因，突变株的致病力则会显著降低[20-21]。引起小麦赤霉病的禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）的PG1和Xyl基因分别编码Pg（内切多聚半乳糖醛酸酶）和调节因子用于调控木聚糖酶的产生，单基因敲除Pg1或xyr1，其酶活性均明显降低，但敲除菌株致病力却未减弱，若将2个基因同时敲除，则发现其毒力明显降低[22]；此外，敲除调控细胞壁降解酶功能的上游基因也能导致突变株的致病力变弱，如SNF1（sucrose non-fermenting 1）基因编码的SNF1蛋白激酶可以解除碳分解代谢阻遏现象，当敲除SNF1后，相关细胞壁降解酶的表达水平降低，从而镰刀菌对甘蓝及拟南芥的致病力变弱[23-24]。将番茄枯萎病菌中编码F-box蛋白的基因Frpl敲除后，突变体中编码果胶酶的PL1、PG1、PG2基因和编码木聚糖酶的XYL2、XYL5基因的表达降低，CWDES基因的表达下降，侵染能力减弱，影响病菌在植物根部的定植和萌发[25-26]。

2.1.3 尖孢镰刀菌定植

尖孢镰刀菌侵入寄主植物后，需要在寄主体内定植才能进行下一步的浸染。真菌细胞外信号调节激酶（YERK1）亚家族成员促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）Fmk1被敲除后，其突变体菌株在番茄果实组织上的侵入性生长减少，且果胶酸裂解酶编码基因Pl1转录水平显著降低，其分生孢子不能分化为穿透菌丝，导致番茄根附着定植能力严重受损[27]。Fow1是第1个被鉴定对植物真菌病原毒力起决定性作用的线粒体蛋白基因，其所编码的蛋白是尖孢镰刀菌定植番茄组织所必需的[28]。Fow2所编码的锌指蛋白家族中的真菌转录因子参与调控尖孢镰刀菌病原体侵染宿主的过程，还影响了病原菌侵入和定植植物组织的能力[29]。

2.2 信号传导机制

病原菌在侵染植物时，会根据寄主植物的特点来调整自身的代谢过程，以达到成功侵染寄主的目的，而这些调控都是在信号传导系统的指令下完成的。病原菌信号传导途径主要有2个：环腺苷酸单磷酸-蛋白激酶A（cAMP-PKA）和促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径，前者主要调控病原菌孢子的形成，而后者主要调控细胞延伸，两者均参与病原菌的侵染过程[30]。真菌具有羟基化类固醇的能力，在尖孢镰刀菌等一些丝状真菌中，黄体酮诱导一种酶系统，将化合物转化为毒性较低的羟基化产物。如Δfgb1突变体菌株中未诱导类固醇羟基化，暗示G蛋白β亚基在黄体酮信号传导中起着重要功能，而外源cAMP能恢复Δfgb1菌株中黄体酮转化活性的诱导，表明cAMP-PKA途径介导了尖孢镰刀菌中的类固醇信号传导[31]。此外，丝裂原活化蛋白激酶信号通路可调控氨基糖和核苷酸糖代谢、糖胺聚糖降解、碳源和磷酸肌醇代谢通路及戊糖和葡糖醛酸盐转换，继而影响尖孢镰刀菌香蕉专化型（Fusarium oxysp orum f. sp. cubense，Foc）病原菌的生长发育和致病性[32]。

3 番茄抗枯萎病机制

番茄寄主对枯萎病菌侵染后的反应是全方位、多方面的，表现为初级代谢的改变，启动和增强抗性相关基因的表达，从而获得不同程度的免疫性。

3.1 寄主分泌抗真菌化合物

番茄在被病原菌侵染时分泌的抗真菌化合物（即α-番茄碱）能够与真菌细胞膜形成固醇复合物，导致真菌毛孔和细胞内容物泄漏，从而抵御Fol的入侵[33]；此外，番茄体内的细胞壁结合态酚在受病原物入侵时，通过合成植保素、木质素、类黄酮等物质提高番茄抗病性[34]。另外，番茄毛状根中的酚类代谢物对于抗枯萎病也至关重要，其可增强番茄植株和根毛部木质素的细胞壁沉积，如4-羟基苯甲酸、香草酸、4-羟基苯甲醛、香草醛和4-香豆酸等[35]。

3.2 激发寄主信号传导途径及保卫反应

植物免疫力通常由被认为是免疫激素的物质来定义，如水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）等对病原体的防御反应有不同的调节作用。植物激素在番茄与尖孢镰刀菌的互作中也起着重要的作用[36]。不能产生ET（ACD过表达）或感知不到这类激素（Nr突变体）的番茄植株，接种Fol后比野生型植株发病症状显著减轻，相反，番茄植株若在积累SA（NahG）的能力上受到损害，则对Fol高度敏感[36]。Fol侵染番茄后，番茄体内水杨酸含量增多，维管褐变和叶片黄化萎蔫的现象显著减少[37]。JA生物合成中受损的def1突变体番茄植株接种Fol后与对照处理相比，在疾病发展方面没有差异，暗示JA似乎不参与这种相互作用；此外，Fol对ACD和Nr番茄植株茎的定植程度较低，而对NahG植物的定植范围比野生型植物更广[36]。通常，抗病品种形成保卫反应较早且速度较快，在感病品种中只出现部分保卫反应且速度较慢；此外，最新的研究报道番茄内生真菌（Endophyte-Mediated Resistance，EMR）对尖孢镰刀菌的抗性不依赖于ET、JA和SA，表明这种对枯萎病的诱导抗性反应不同于经典的诱导系统抗性（Induced Systemic Resistance，ISR）反应，为控制番茄枯萎病提供了不依赖于常规防御途径的可能性[36]。

3.3 寄主抗性基因诱导表达

早在1929年，研究人员从番茄野生型Lycopersicon esculentum Mill.的一个突变体PI79522中发现了一个显性抗病基因I（Immunity），且抗性是由单个显性基因决定的，杂交后代的抗性无法降低[37-39]。随后又发现番茄枯萎病病原真菌分泌的效应子可以触发寄主ETI（Effector-Triggered Immunity）免疫反应，或抑制寄主抗性基因（Resistant gene, R）的表达。目前，番茄基因组中已有多个R基因被鉴定，应答不同Fol生理小种，分别为I 、I-1、I-2、I-3[38]。Fol侵入番茄后，在番茄木质部中分泌蛋白效应子Avr3 蛋白，诱导宿主的I-3抗性基因大量表达，从而诱导番茄启动防御机制；同时，AVR1基因编码的蛋白效应子不仅与I-1基因相对抗，同时也会抑制I-2和I-3介导的免疫反应[40]。Fol侵染番茄时，番茄内源miRNA（如Sly-miR5300和Sly-miR482e-3p）的表达被抑制，其靶向的编码NBS-LRR类抗病蛋白的R基因表达水平上调，通过负调控的方式参与了番茄抗枯萎病的过程[41-42]；此外，Sly-miR482e-3p还能调控其靶基因SlSGT1 的表达，通过介导乙烯信号传递通路以应答病原菌入侵[43]。

4 展望

目前，关于农作物枯萎病的防治方法主要有生物防治、物理防治和化学防治，但这些防治效果较缓慢，易对环境造成污染，且在番茄果实上有残留，影响人体健康。基于RNA的研究进展发现，RNAi（RNA Interference）是基因转录后沉默作用（Post-Transcription Gene Silence, PTGS）的重要机制之一，是近年来重要的生物学发现之一。RNAi主要通过dsRNA特异阻断体内特定基因表达，由mRNA降解诱使细胞表现出特定基因缺失的表型[44]。在真菌中参与RNAi作用机制的蛋白主要有AGO、DCL和RDR[45]。真菌病害如灰霉菌（B. cinerea）能主动吸收环境中外源sRNA，并靶向调控Bc-DCL1 和Bc-DCL2表达，从而影响病原菌对番茄的侵染过程[46]。由此，科学家提出了喷雾诱导的基因沉默（Spray-Induced Gene Silencing，SIGS）概念，为未来农业生产病虫害防治提出了全新的方向[47]；此外，研究表明，尖孢镰刀菌FolRDR1与病原菌致病力密切相关，且FolRDR1与其他尖孢镰刀菌生理小种，如尖孢镰刀菌香蕉专化型、尖孢镰刀菌黄瓜专化型、尖孢镰刀菌萝卜专化型等高度保守，可作为开发基于RNAi的新型环境友好型广谱生物制剂的理想靶标[48-52]。

随着时代发展，我国农业和生态环保产业逐步实现了协同发展，农作物病虫害绿色防控理念和技术被广泛应用于农业植保建设之中，推动了我国社会各产业均衡发展。实施绿色防控是贯彻“公共植保”和“绿色植保”理念的重大举措，是发展现代农业、建设“资源节约、环境友好”两型农业的有效途径。随着对番茄抗枯萎病研究的不断深入，借助于现代分子生物学技术与手段，致力于科学地运用RNAi技术生产生物制剂的开发并投入实际应用中，还需要科研人员进一步潜心研究。