基于UPLC-QqQ-MS技术的黄柏生品及其盐炙品中10种成分量的变化

李 丽， 张 超， 郑 威， 于颖琦， 张 凡， 高 慧

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

黄柏，习称川黄柏，为芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid的干燥树皮，味苦性寒，具有清热燥湿、解毒疗疮、泻火除蒸的功效[1]。黄柏中含有大量生物碱类、柠檬苦素类成分，其中生物碱类作为主要的活性成分[2]，包括黄柏碱、木兰花碱、药根碱、巴马汀、小檗碱等，具有抗炎[3]、抑菌[4]、调节代谢[5]、抗氧化[6]等药理作用。小檗红碱作为黄柏盐炙过程中由小檗碱转化新生成的成分，同样具有抗炎、抑菌的功效[3]，同时巴马红汀、药根红碱作为实验室自制成分，由巴马汀、药根碱分别转化而得，与小檗红碱具有相似的化学转化历程，推测其与小檗红碱具有相似的药理作用，故本研究将小檗红碱、巴马红汀、药根红碱也作为含量测定的指标性成分。此外，黄柏药材中还含有柠檬苦素类成分黄柏酮和黄柏内酯，黄柏味苦性寒，苦味药多用治热证，具有清热燥湿、泻火的功效，柠檬苦素类与生物碱类成分均是黄柏具有苦味的原因[7]，同时具有抗菌[8]、抗炎[9]、抗癌[10]等药理活性，因此本实验亦将黄柏酮与黄柏内酯纳入指标，以期更加全面的评价黄柏饮片。

目前测定黄柏中生物碱类、柠檬苦素类成分含量的测定方法主要是HPLC法[7, 11]，其不足之处主要是需要在2个色谱条件下分别测定这两类成分，且黄柏药材中各成分之间含量差异大，实验室前期曾采用液相色谱法测定，发现各成分间相互干扰严重，多种成分含量同时测定色谱条件摸索困难，而UPLC-QqQ-MS作为一种新的分析技术，其质谱采用特定离子对扫描模式，可以通过提取质量色谱图准确鉴别化合物，克服了液相色谱分离度差的问题，灵敏度高，在短时间内即可达到有效分离[12]，拥有更低的定量下限[13]，节约时间与成本。

古代医籍中关于黄柏炮制方法较为丰富，医者多会根据临床使用的需要而选取不同的辅料和方法对其加以炮制。现今对于黄柏的炮制方法研究多集中在盐黄柏、酒黄柏、黄柏炭等几个炮制品种，并报道其含有的化学成分在炮制的过程中会出现明显的质变和量变的情况[14]。盐炙法是传统中药炮制方法之一，也是目前黄柏的主流炮制方法，盐黄柏始载于《雷公炮炙论》，2020年版《中国药典》没有明确的炒制时间与炒制温度，为了有效控制盐黄柏饮片的质量，并进一步研究盐黄柏在炒制过程中活性成分量变规律，故本实验中采用UPLC-QqQ-MS法对黄柏生品及其不同炒制程度的盐炙品中10种成分进行含量测定，以发现不同炒制温度、炒制时间盐黄柏中活性成分量变规律，并为盐黄柏质量评价及质量标准提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters ACQUITY UPLC/Xevo TQD超高效液相色谱串联飞行质谱仪(美国Waters公司，包括MassLynx 4.1工作站)；FA1004B型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；AE240型分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Milli-Q型超纯水仪(美国Millipore公司)；KQ-250E型医用超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料 木兰花碱(四川省维克奇生物科技有限公司，批号wkq16050801)；盐酸小檗碱、盐酸药根碱(均购自成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为MUST-16031814、MUST-16040702)；盐酸巴马汀(上海圻明生物科技有限公司，批号151120)；小檗红碱、黄柏内酯、黄柏酮、黄柏碱(大连美仑生物科技有限公司，批号分别为A1107AS、M0606AS、F0102AS、M0107AS)；巴马红汀及药根红碱均为实验室自制(纯度>98%)；无碘盐(购自大连盐业有限公司)。质谱级甲醇、乙腈均购于日本Sigma公司，色谱级甲醇，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

黄柏药材购自四川雅安，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮。

2 方法

2.1 炮制品制备

2.1.1 生黄柏 取黄柏原药材，洗净，润透，切细丝，干燥，即得。

2.1.2 不同炮制程度的盐黄柏 取生黄柏，放入适宜的容器中，加盐水拌匀(每100 g黄柏使用2 g食盐)，闷润2 h，使得辅料盐水被黄柏吸尽，在炒制容器内于130～140、150～160、170～180 ℃下分别炒制3、4、5、6、7 min，取出，放凉，即得。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取黄柏碱、木兰花碱、药根红碱、药根碱、巴马红汀、小檗红碱、巴马汀、小檗碱、黄柏内酯、黄柏酮对照品置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，制备成质量浓度分别为0.091 2、0.031、0.010 5、0.049、0.002 9、0.137 25、0.001 275、0.418、0.088、0.004 85 mg/mL混合对照品溶液，4 ℃冷藏，备用。

2.2.2 供试品溶液 取生黄柏、不同炒制程度盐黄柏适量，粉碎，过60目筛，分别精密称取0.2 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL 1%醋酸甲醇溶液，称定质量，超声(250 W，40 kHz)处理30 min，取出，放冷，用1%醋酸甲醇溶液补足失质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.3 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱，程序见表1；体积流量0.25 mL/min；柱温35 ℃；进样量1 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.4 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI源)，正离子扫描模式；离子扫描范围m/z50～1 000；毛细管电离电压3.5 kV；源温度150 ℃；脱溶剂温度250 ℃；脱溶剂气体体积流量800 L/h；锥孔气体体积流量50 L/h；多反应监测模式(MRM)。10种成分的质谱参数见表2，MRM模式下的色谱图、总离子流图见图1～2。

表2 黄柏中10种成分质谱MRM模式下参数

1.黄柏碱 2.木兰花碱 3.药根红碱 4.药根碱 5.巴马红汀 6.小檗红碱 7.巴马汀 8.小檗碱 9.黄柏内酯 10.黄柏酮

1.黄柏碱 2.木兰花碱 3.药根红碱 4.药根碱 5.巴马红汀 6.小檗红碱 7.巴马汀 8.小檗碱 9.黄柏内酯 10.黄柏酮

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液0.02、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，加入适量甲醇溶液，定容至10 mL，制备成系列混合对照品溶液，在“2.3”“2.4”项条件下测定，并记录各测定成分峰面积，以对照品的质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行回归，结果见表3。

表3 各成分线性关系

2.5.2 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，在“2.3”“2.4”项条件下重复进样6次，测定黄柏碱、木兰花碱、药根红碱、药根碱、巴马红汀、小檗红碱、巴马汀、小檗碱、黄柏内酯、黄柏酮峰面积RSD分别为2.67%、2.01%、2.02%、1.78%、1.55%、1.01%、0.98%、0.97%、1.23%、1.11%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 精密吸取同一盐黄柏供试品溶液，分别于0、2、4、6、10、24 h，在“2.3”“2.4”项条件下进样，测得黄柏碱、木兰花碱、药根红碱、药根碱、巴马红汀、小檗红碱、巴马汀、小檗碱、黄柏内酯、黄柏酮峰面积RSD分别为1.34%、1.56%、0.99%、2.03%、2.22%、1.75%、1.64%、1.44%、1.43%、0.98%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 精密称取同一批盐黄柏样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”“2.4”项条件下进样，测得黄柏碱、木兰花碱、药根红碱、药根碱、巴马红汀、小檗红碱、巴马汀、小檗碱、黄柏内酯、黄柏酮含量RSD分别为1.30%、1.34%、1.21%、1.45%、1.34%、1.31%、0.99%、1.76%、1.89%、2.02%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验 取已知含量的盐黄柏样品0.1 g，平行6份，精密称定，分别精密加入对照品适量(与0.1 g盐黄柏样品成分含量相当)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”“2.4”项条件下测定含量，计算回收率。黄柏碱、木兰花碱、药根红碱、药根碱、巴马红汀、小檗红碱、巴马汀、小檗碱、黄柏内酯、黄柏酮的平均回收率分别为100.55%、99.83%、97.68%、99.78%、97.24%、100.46%、97.88%、102.23%、99.61%、96.79%，RSD分别为0.61%、0.01%、0.66%、0.13%、0.26%、0.79%、0.37%、0.41%、0.48%、0.36%。

2.6 样品含量测定 分别精密称取生黄柏、不同炒制程度盐黄柏粉末0.2 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”“2.4”项条件下进样，计算各成分含量，结果见表4、图3。

表4 生黄柏及不同炒制程度盐黄柏各成分含量测定结果(mg/g)

图3 黄柏生品、盐炙品中各成分变化趋势图

3 结果

由含量测定结果可知，盐黄柏炒制过程中黄柏碱、木兰花碱、药根碱、巴马汀、小檗碱、及黄柏内酯6种成分的含量整体呈下降趋势，尤其在170～180 ℃炒制温度下6种成分的含量下降最为显著；巴马红汀、小檗红碱、药根红碱3种成分含量整体呈上升趋势，尤其在170～180 ℃炒制温度下3种成分含量上升最为显著；黄柏酮在170～180 ℃、炒制4 min时含量较高。

在炒制温度130～140 ℃、炒制时间6～7 min条件下检测到新成分巴马红汀，且在170～180 ℃、3 min条件下巴马红汀含量最高，同一炒制时间下，高温较低温条件下巴马红汀的含量更高；小檗红碱含量随着炒制时间和炒制温度增加整体呈上升趋势，小檗碱含量呈下降趋势，在170～180 ℃、6～7 min条件下小檗碱含量降低最为明显；药根红碱含量随着炒制时间和炒制温度的增加整体呈上升趋势，药根碱含量随着炒制时间的增加整体呈降低趋势，在170～180 ℃、6～7 min条件下药根碱含量降低最为显著。

4 讨论

不同炮制程度的盐黄柏在炮制过程中，颜色由黄色逐渐变为红褐色，提示着黄柏中的化学成分可能发生了变化[15]，在前期研究当中发现黄柏在炮制过程其小檗碱成分发生了质变，且随着炮制温度的升高、时间的延长，盐炙黄柏中部分盐酸小檗碱转化为小檗红碱[16]，此反应的发生条件在120 ℃以上[17]，且温度控制在180 ℃、炒制时间控制在8 min时小檗红碱的含量最高；而此外黄柏中药根碱、巴马汀等成分同为小檗原碱型生物碱，化学结构构型与小檗碱成分类似，故推测黄柏在炮制前后其药根碱、巴马汀成分与小檗碱一样也会发生相应的化学变化。实验室后期对药根碱和巴马汀化学成分单体进行了模拟炮制研究，发现黄柏在盐炙过程中药根碱、巴马汀成分与小檗碱一样发生了类似的化学反应历程，即为药根碱转化为药根红碱[18]，巴马汀转化为巴马红汀。从目前的文献报道来看尚未见有对黄柏盐炙过程中药根红碱和巴马红汀2种新成分量变变化研究的报道，基于此，本实验采取了温度为130～180 ℃、炒制时间3～7 min的炮制条件，使用UPLC-QqQ-MS法，在正离子模式下同时测定了黄柏生品及其盐炙品中生物碱类和柠檬苦素类共10种成分，同时包含了2种新生成成分，以期可为黄柏饮片及其制剂成分的分析和质量控制提供一定的科学依据。

通过上述实验表明，黄柏经盐炙后其化学成分发生了量变和质变，从而也会对黄柏体内代谢产物和入血成分产生相应的影响，最终导致其药性和功效的变化。在阐释黄柏炮制原理的过程中，以单一成分的改变并不能很好的表征整个黄柏炮制过程的功效和药性变化，故本实验采用了液质联用技术对黄柏中生物碱类和柠檬苦素类10种成分的量变变化进行了全面分析。但为了更深入的解析盐黄柏的炮制原理，还应结合体内代谢、吸收过程的考察，运用现代联用技术，分析黄柏盐炙过程中活性成分经体内Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢的产物分析鉴定，建立一种快速有效的黄柏代谢产物分析方法，为进一步明确盐黄柏在体内的药效物质基础及其质量控制的研究奠定基础，也为盐黄柏的药理活性研究以及临床上的开发利用提供参考。