甘肃、青海和宁夏地区牛病毒性腹泻病毒Erns基因的变异分析

2021-11-24高闪电王锦明田占成独军政王建东常惠芸关贵全李有全

畜牧兽医学报 2021年11期

高闪电，王锦明，田占成，独军政，王建东，常惠芸，关贵全，李有全，殷宏, 2*

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009；3.宁夏农林科学院动物科学研究所，银川 750002)

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)属于黄病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)，主要感染牛，导致腹泻、呼吸道症状、流产或黏膜糜烂[1]。病毒基因组RNA包含5′UTR、开放阅读框以及3′UTR保守的结构，编码C、Erns、E1、E2四种结构蛋白和7～8种非结构蛋白。Erns、E1、E2镶嵌在病毒脂质双层囊膜上，与囊膜内由C蛋白和病毒RNA构成的衣壳共同组成完整的病毒粒子[2]。E2是BVDV最主要的抗原蛋白，在诱导宿主体液免疫和细胞免疫中发挥重要的作用，是决定疫苗免疫保护的关键蛋白。Erns为高度糖基化蛋白，具RNA酶活性，除参与病毒粒子组成，还可从感染细胞分泌至胞外。Erns作为瘟病毒特有蛋白，也可诱导中和抗体的产生，可作为病毒持续感染的标志物，广泛用于BVDV持续与急性感染的鉴别诊断[3]，但相关研究发现检测Erns的免疫组织化学法或商品化试剂盒存在漏检现象，表明Erns蛋白在毒株之间存在抗原差异[4]。

BVDV分离株间抗原性、基因组核苷酸存在较大差异，目前主要依据5′UTR、N基因核苷酸差异将其分为BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3基因型以及BVDV-1a～BVDV-1w、BVDV-2a～2d等基因亚型[5-6]。根据分离株的细胞培养特性，可将BVDV分为非致细胞病变(ncp)和致细胞病变(cp)两种生物型，田间分离株多为ncp型且与牛急性感染、流产和持续性感染(PI)有关，cp型BVDV感染PI牛可导致黏膜病。在我国报道的BVDV分离株表现为较高的亚型多样性，可分为13种基因亚型(BVDV-1：11种；BVDV-2：2种)及BVDV-3基因型[6-12]。目前我国BVDV流行株的抗原基因E2的多态性已初步阐明[13]，但关于毒株Erns基因的信息较少。为了系统了解我国BVDV流行株Erns基因的分子特征及遗传演化规律，本研究测定分析了2013—2019年间我国甘肃、青海、宁夏省区主要BVDV流行株的Erns基因序列，以期进一步丰富我国BVDV的抗原变异基础研究，为疫苗的分子设计提供必要的技术储备。

1 材料与方法

1.1 材料

2013—2019年，甘肃、青海、宁夏规模化牛场送检的疑似牛病毒性腹泻发病牛的EDTA抗凝血150份(表1)，冻存于-80 ℃。致细胞病变生物型对照毒株BVDV-AV69 购自中国兽医药品监察所，无BVDV污染的牛肾细胞(MDBK)、BVDV-1p基因亚型分离株Camel-5，由本实验室保存，BVDV抗原检测试剂盒为爱德士公司产品，FITC标记的猪抗BVDV多克隆抗体为美国VMRD公司产品，RNAsimple总RNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，一步法RT-PCR试剂盒HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit、DH5α 化学感受态细胞、质粒提取试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品，Trans2K DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司，pMD18-T 克隆载体购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

表1 样品信息及BVDV RT-PCR检测结果

1.2 引物

根据GenBank中收录的BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3基因组序列，设计引物ErnsF：5′-AGCATTGTTRGCRTGGGC-3′，E1R：5′-AACCAYAGTATRCCTTGYA-3′，用于扩增BVDV基因组Erns-E1区，预期目的片段为1 296 bp。同时合成引物5′UTRF(5′-CTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTA-3′)和5′UTRR(5′-CAACTCCATGTGCCATGTACAGCA-3′)，用于扩增BVDV基因组5′UTR区。

1.3 RNA提取及RT-PCR

参照RNAsimple 总RNA提取试剂盒说明书，分别从250 μL EDTA抗凝血和Camel-5株培养物提取总RNA。利用一步法RT-PCR试剂盒HiScript II One Step RT-PCR Kit，以50 μL反应体系扩增Erns-E1 DNA片段。电泳切胶回收后与pMD18-T 载体连接，转化DH5α感受态细胞，PCR鉴定并将阳性克隆摇菌，委托生工生物工程(上海)公司测序。同时选取测序正确的样品RNA扩增5′UTR区并克隆测序。

1.4 病毒分离

根据爱德士BVDV抗原检测试剂盒操作说明检测抗凝血中BVDV抗原，参照文献[14]，利用阳性抗凝血样品制备牛淋巴细胞裂解液并接种至MDBK单层细胞，盲传3代后，接种MDBK单层细胞，利用FITC标记的猪抗BVDV多克隆抗体进行免疫荧光检测细胞培养物中的BVDV抗原。

1.5 序列分析

利用VecScreen、DNASTAR、BioEdit等软件对获得的序列进行分析。根据GenBank数据库中收录的SD-15毒株(登录号为M96751)的Erns基因和5′UTR区，以Clustal W方法比对获得Erns基因和5′UTR区核苷酸信息。利用DnaSP 5.10、BioEdit 分析Erns基因核苷酸以及推导氨基酸序列的变异位点。利用BLAST在线分析序列与GenBank中收录毒株Erns基因的同源性，并利用Mega7.0软件包构建系统进化树。

2 结果

2.1 基因克隆及序列测定

从150份抗凝血提取总RNA，经RT-PCR扩增病毒Erns-E1区(1 296 bp)，共获得56份DNA，测序均为BVDV特异序列，总体阳性率为37.33%，其中甘肃省、青海省、宁夏回族自治区BVDV阳性率分别为37.68%、35.71%、40.00%。比对并去掉相同序列后获得33条Erns序列，长度均为681 bp，无核苷酸插入或缺失，编号并提交GenBank数据库，登录号为KY675201～KY675227、MW560180～MW560185。

2.2 病毒分离与相似性分析

GenBank中未收录BVDV-1p亚型毒株的Erns序列，因此测定实验室保存的Camel-5株Erns序列(登录号为KY675228)并作为参考序列。分析发现这些流行株属于9个基因亚型：BVDV-1a(2株)、BVDV-1b(5株)、BVDV-1c(1株)、BVDV-1d(3株)、BVDV-1m(11株)、BVDV-1o(1株)、BVDV-1p(4株)、BVDV-1q(4株)、BVDV-2a(1株)。利用BVDV抗原阳性抗凝血GS5、QH4、QH9、NX1、NX3、NX201902进行病毒分离，在MDBK细胞未见细胞病变，经免疫荧光鉴定分离株均为非致细胞病变型，利用细胞培养物提取RNA并扩增Erns基因测序，与利用抗凝血样品扩增测序结果一致。在这些亚型株中，BVDV-2a亚型NX3株Erns基因序列与美国分离株9231(登录号：MH806437)相似性最高(97.75%)，高于国内新疆分离株XJ04(FJ527854，94.73%)、山东分离株SD-1(MK599227，92.13%)以及吉林分离株JZ05-1(GQ888686，91.59%)。GS11、QH2、QH11、QH18株Erns序列相似性为89.4%～98.9%，与Camel-5株Erns基因核苷酸序相似性为90.0%～95.1%，同属BVDV-1p基因亚型。NX2019/02株与GenBank中收录的BVDV-1m亚型 SD-15 株Erns基因(登录号：KR866116)核苷酸一致性为84.73%，其5′UTR与1v毒株EN-19(登录号：MN417826)的核苷酸一致性为96.39%，因此暂定NX2019/02株为BVDV-1v基因亚型。各基因亚型株间Erns序列相似性矩阵结果表明，BVDV Erns核苷酸在1a～1d经典亚型相似性较高(79.8%～85.9%)、在1m～1v较新亚型也表现为较高相似性(81.0%～87.3%)，以BVDV-1m和BVDV-1p流行株亚型间相似性最高(87.3%)，与作者前期在各亚型BVDV株E2基因比较结果类似[13]。Erns基因在经典亚型组和新亚型组株间差异较大，以BVDV-1d亚型与BVDV-1p亚型流行株间相似性最低(76.7%)。BVDV-1v NX2019/02株与BVDV-1m～1q亚型BVDV株Erns序列相似性(82.0%～86.3%)高于经典亚型BVDV-1a～1d(77.8%～80.7%)，表明BVDV-1m～1v等新出现毒株在起源上关系较为密切。

2.3 基因变异性分析

变异位点分析显示流行株Erns基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列变异位点分别为49.34%(336/681)和26.43%(60/227)，小于作者前期测定的BVDVE2基因(核苷酸和氨基酸变异位点分别为61.76%和60.69%)。在推导的Erns氨基酸序列，His30、His74、Glu75、Lys78、His79RNA酶活性位点以及139KKGK142dsRNA作用基序保守。在Erns蛋白存在7个N-糖基化位点，位于氨基酸第2、11、26、65、95、100、217位，其中第26位糖基化位点(26 NRSL)在BVDV-1m、1o、1p、1q、1v亚型株糖基化位点移位(24 NVSR)(图1)。此外，在1m亚型GS25株、1p亚型QH2株参与链内二硫键形成的第171位半胱氨酸发生变异，1 d亚型QH9株该位点半胱氨酸转位至第181位。

图1 各亚型BVDV株Erns N-糖基化位点(N95、N100、N217糖基化位点未显示)

2.4 系统进化分析

利用Mega7.0对获得Erns基因核苷酸序列与GenBank中收录的参考株进行序列比对并进行系统进化分析，结果表明，在西北地区BVDV表现为区域亚型多样性(甘肃省7种：1a、1b、1c、1m、1o、1p、1q基因亚型；青海省5种：1b、1d、1m、1p、1q基因亚型；宁夏区5种：1d、1m、1q、2a以及1v新基因亚型)。在3省区均存在1m、1q基因亚型BVDV株，以1m基因亚型株最为普遍(33.33%，11/33)，且1m 亚型株Erns基因相似性较高(93.5%～97.9%)，未发现明显地域性差异；其次为甘肃及青海2省共存的1b亚型(5/33)和1p亚型(4/33)(图2A)。为验证基于Erns基因的系统进化分析结果，进一步扩增测定NX2019/02株等19条5′UTR序列，构建系统进化树(图2B)，证实NX2019/02株属BVDV-1v新基因亚型。1p基因亚型双峰驼分离株Camel5Erns基因与甘肃株GS11的Erns基因核苷酸相似性(95.1%)高于QH2、QH11等青海流行株(90.0%～90.4%)，1q基因亚型GS26株、QH5株、QH8株分别与Camel-6双峰驼分离株以及SD0803猪源分离株存在较高Erns基因相似性(分别为98.3%和96.4%～98.6%)。利用Erns基因进化树和5′UTR进化树分析BVDV株亲缘关系结果较一致，但5′UTR 进化树揭示GS6株与青海分离株的进化关系效果略次于Erns基因进化树(图2A、B)。由于Erns基因在BVDV株间差异性略小于E2基因但显著高于5′UTR区段，因此在精细定位BVDV株的进化关系中具有显著优势。

图2 基于Erns基因(A)和5′UTR核苷酸(B)的各亚型BVDV株系统进化分析

3 讨论

自1946年美国首次报道牛病毒性腹泻，至今已有70余年。BVDV以牛为主要宿主，还可感染羊、猪、牦牛、鹿等家畜和多种野生偶蹄动物[15]。BVDV-1基因型在世界各地普遍流行，而BVDV-2 基因型在北美、南美、欧洲、亚洲流行，目前已发现BVDV-1a～1w、BVDV-2a～2d等基因亚型。BVDV-3基因型主要分布于巴西、泰国、意大利、孟加拉国、印度、阿根廷、土耳其等国家。相关研究表明，在我国牛BVDV总体抗体阳性率高达57%，RT-PCR阳性率约为27.1%[16]，但病毒抗原阳性率较低(0.71%～3.66%)[17-18]，流行株主要有BVDV-1a～1d、BVDV-1m～1q、BVDV-1u～1w、BVDV-2a～2b等亚型[6-12]。此外，在河南、山东省相继报道山羊、绵羊以及肉牛因BVDV-3自然感染发病[19-20]。本研究利用疑似BVDV感染牛抗凝血样本研究不同亚型株Erns抗原基因的差异，RT-PCR总体阳性率(37.33%)和抗原阳性率略高于前期普查性研究。作者发现在西北地区1a、1b、1d、1q亚型BVDV流行态势与前期报道类似[21-23]，但BVDV-1m亚型株目前流行最普遍。BVDV-1p基因亚型株最早于2007年分离于北京奶牛[7]，在我国江苏和西南地区山羊以及西北区双峰驼均有报道[24-26]，在本研究中发现其在西北省区其检出率与1q株相当，仅次于BVDV-1m株。在宁夏首次检出BVDV-2a基因型，但其与我国前期分离株的亲缘关系相对较远，与之类似近期北美商品血清来源的BVDV-2分离株的报道[27]，提示国外传入BVDV-2株的风险不容忽视。

目前，BVDV分离株的亚型鉴定大多基于5′UTR、N基因核苷酸相似性，由于不同亚型株的基因重组可能造成BVDV株遗传分析的偏差[28]。因此日本学者曾增加E2 N端编码区、NS3基因片段、NS5B-3′UTR 的系统进化分析以提高准确性[29]。抗原编码基因在BVDV株间变异最大，在揭示病毒遗传演化规律中更具优势。与作者前期发表的BVDV流行株E2基因的分析结果类似[13]，本研究发现Erns基因也可作为研究BVDV遗传演化的靶标基因，精细定位BVDV株进化关系。此外，我们发现RNA酶活性位点在BVDV不同亚型株高度保守，但1m～1q、1v等新亚型株Erns糖基化位点错位，由于ErnsRNA酶活性位点、dsRNA结合活性位点、糖基化在影响病毒抗原性以及宿主细胞INF产生中具有重要调控作用[30-31]，国内流行株Erns糖基化位点错位是否影响毒株抗原性或宿主细胞IFN反应的差异，还有待深入研究。

近期研究人员提出了1f、1g、1h、1m～1o、1q亚型株进化的关联性[32]，本研究聚焦于国内流行株，首次全面获取了BVDV Erns编码基因信息，通过同源性分析进一步揭示了1m～1v亚型BVDV流行株的密切亲缘关系。前期研究人员在山东奶牛[6]和黑龙江肉牛[33]报道了BVDV新亚型1v，本研究进一步发现在宁夏区奶牛中也存在同亚型流行株，这一结果提示1v亚型株在我国的时空分布规律及其在我国BVDV株演化中扮演的角色值得关注。