不同时间点两性霉素B联合氟康唑抗真菌效果研究

朱乘光， 叶星辰， 任彪， 周学东， 程磊

1.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科，四川成都（610041）； 2.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心，四川 成都（610041）

近年来，随着抗生素的广泛使用、免疫缺陷疾病的发病率增高，我国侵袭性念珠菌病发病率呈现增高趋势［1］。白色念珠菌（Candida albicans，C.albicans）是人类主要的致病性真菌之一，可导致念珠菌血症及侵袭性念珠菌感染等诸多真菌感染性疾病，是临床上病死率最高的致病真菌，在免疫功能低下的人群中更为严重［2-3］。在抗真菌治疗应用中，多烯类药物，如两性霉素B（amphotericin B，AmB）和氮唑类药物，如氟康唑（fluconazole，FLC）是目前最为常用的抗真菌药［4］。临床上常将AmB与氮唑类药物联合应用以达到更好的治疗效果，减少副作用发生［5-7］，但两者联用的作用机制仍存在较多争议［8-10］。本实验将探讨AmB 与FLC 在体外的时间依赖性相互作用，为揭示两者不同条件下的相互作用关系提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验菌株、培养条件及药物准备

白色念珠菌标准株SC5314 购自美国标准生物品收藏中心（保藏号：ATCC MYA-2876，American Type Culture Collection）。使用平板画线法于酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）活化菌株，配方：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%，于35 ℃，5%CO2的条件下过夜孵育。于上述培养条件下的白色念珠菌，在RPMI 1640 培养基中制备菌悬液，菌液终浓度为（0.5 ～2.5）× 104CFU/mL。将AmB 和FLC 分别溶于二甲基亚砜（DMSO）中以制备药物储备液，浓度分别为10 mg/mL 与2 mg/mL，冷藏待用。

1.2 两倍稀释法测定最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）

根据美国临床与实验室标准协会（CLSI）文件M27，在96 孔板中，使用微量肉汤两倍稀释法在RPMI 1640 培养基中进行抗真菌活性试验。于上述培养条件下的白色念珠菌，在RPMI 1640 培养基中制备菌悬液，菌液终浓度为（0.5～2.5）× 104CFU/mL。在96 孔板中依次加入80 μL 菌悬液与1μL 两倍连续稀释后的药物（AmB 或FLC）或溶媒对照DMSO，使药物在96 孔板各孔终浓度分别为2、1、0.5、0.25、0.12、0.06、0.03、0 μg/mL。使用空白RPMI 1640 培养基作阴性对照，将孔板置于35 ℃孵育24 h。将各孔菌液吹打均匀，多功能酶标仪检测OD 600 nm 条件下浊度值，MIC 是在实验条件下观察不到真菌生长的最低浓度。所有实验重复3 次。

1.3 平板复苏实验及不同时间点药物相互作用观察

1.3.1 DMSO 对AmB、FLC 作用效果影响 为排除溶媒对照（DMSO）及基础DMSO 环境对AmB、FLC的作用效果影响，取3 块无菌96 孔板，分别加入80 μL 菌悬液及1 μL DMSO，此后在不同的时间点（0、2、4、6 h），分别加入：①1 μL AmB，使AmB 终浓度分别为0.25、0.125 μg/mL；②1 μL FLC，使FLC 终浓度分别为0.06、0.03 μg/mL；③1 μL DMSO。

1.3.2 低浓度AmB 对FLC 的作用效果影响 向96孔板中依次加入80 μL 菌悬液与1 μL FLC，使FLC终浓度为2、1、0.50、0.25、0.12、0.06、0.03、0.016、0.008、0.004 μg/mL［3］，此后在不同的时间点（0、2、4、6 h）加 入1 μL AmB，使AmB 终 浓 度 为0.25、0.125 μg/mL。同时，另设阴性对照组加入1 μL DMSO。

1.3.3 低浓度FLC 对AmB 的作用效果影响 向96孔板中依次加入80 μL 菌悬液与1 μL AmB，使AmB 终 浓 度 为2、1、0.50、0.25、0.12、0.06、0.03、0.016 μg/mL，此后在不同的时间点（0、2、4、6 h）分别加入1 μL FLC，使FLC终浓度为0.06、0.03 μg/mL。同时，另设阴性对照组加入1 μL DMSO。

将以上96 孔板于35 ℃孵育，过夜培养。将96孔板各孔菌液吹打混匀，从每孔菌悬液中抽取2 μL，滴加于新鲜的YPD 平板上以复苏菌液。复苏平板于35 ℃孵育，过夜培养，通过比较不同时间点及不同浓度AmB 与FLC 处理组菌悬液是否可在YPD 平板上复苏，及处理组复苏菌落较阴性对照组复苏菌落的大小来初步判断药物之间相互作用。

1.4 菌落计数实验

于上述培养条件下的白色念珠菌，在RPMI 1640 培养基中制备菌悬液，菌液终浓度约为（0.5～2.5）× 104CFU/mL。本实验分为以下两组，分别观察AmB 及FLC 相互作用对抗真菌效果的影响。

1.4.1 低浓度AmB 对FLC 抗真菌效果的影响 向96 孔板中依次加入80 μL 菌悬液与1 μL FLC，使各孔FLC 均达到抑菌浓度（0.25 μg/mL），分别在在不同的时间点（0、2、4、6 h）各孔加入1 μL AmB，使各孔AmB 终浓度为0.125、0.25 μg/mL，加入等体积DMSO 设置为单药对照。

1.4.2 低浓度FLC 对AmB 抗真菌效果的影响 向96 孔板中依次加入80 μL 菌悬液与1 μL AmB，使各孔AmB 均达到抑菌浓度（1 μg/mL），分别在不同的时间点（0、2、4、6 h）各孔加入1 μL FLC，使各孔FLC 终浓度为0.03、0.06 μg/mL，加入等体积DMSO设置为单药对照。

将以上孔板孵育于35 ℃孵育，过夜培养。将96 孔板各孔菌液吹打混匀，从每孔菌悬液中抽取20 μL，滴加于新鲜的YPD 平板上使用无菌推棒涂匀。于35℃孵育，过夜培养，于次日进行菌落计数，计算菌落形成单位（colony-forming units，CFU），使用在后续时间点（0、2、4、6 h）未滴加药物的菌液CFU 均数作标准化，分别计算各孔CFU 的差异倍数［5］，各时间点的CFU 差异倍数计算公式如下：Fold Changes by CFU ＝CFU药物处理组/CFU阴性对照组均数。每组实验进行3 次平行重复。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计学软件进行相关数据结果分析，计量资料用均数±标准差表示。采用单因素方差分析处理所得结果，P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 AmB、FLC 对白色念珠菌的药敏结果

结果显示，随着药物浓度升高，处理后白色念珠菌浊度逐渐降低，提示白色念珠菌真菌浓度逐渐降低，药物的抑菌能力逐渐提高，AmB 对白色念珠菌的MIC 为1 μg/mL、FLC 的MIC 为0.25 μg/mL。见图1。

2.2 DMSO 与低浓度AmB 或FLC 无相互作用

结果显示，使用溶媒DMSO 处理后，在不同时间点加入DMSO、低浓度AmB（0.25 或0.125 μg/mL）或FLC（0.06、0.03 μg/mL），白色念珠菌的生长并不受影响（图2a）。FLC 是一种抑菌药物，真菌在高浓度药物处理后依旧可以复苏，而AmB 为杀菌药物，只有少量真菌能够在1 μg/mL 药物处理后存活，当AmB 浓度达2 μg/mL，能够完全抑制真菌生长（图2b）。以上溶媒阴性对照组及单药对照组结果说明DMSO 不会影响白色念珠菌生长，同时不会影响两种药物对白色念珠菌的作用。

2.3 不同时间点低浓度AmB 对FLC 抑制白色念珠菌效果无影响

Figure 1 Antifungal activities of AmB and FLC图1 AmB 与FLC 对白色念珠菌的抑菌效果

Figure 2 Interactions between DMSO and low concentrations of AmB or FLC图2 DMSO 与低浓度AmB 或FLC 无相互作用

本结果中，在不同时间点加入低浓度AmB（0.25、0.125 μg/mL）均 未 改 变 不 同 浓 度FLC（0.004～0.5 μg/mL）的抑制真菌能力，未能表现出明显的相互作用。进一步通过菌落计数进行定量检测分析加入AmB 的不同时间点对FLC 抗真菌性的影响，发现在加入FLC 后的不同时间点（0、2、4、6 h）加入低浓度AmB 均未显著改变FLC 的抑菌作用（P＞0.05）。分析AmB 低浓度处理后不同时间点对FLC 抗真菌性能的影响，观察不同时间点（0、2、4、6 h）FLC 抑菌效果的改变，结果显示FLC 的抑菌作用并未发生改变（P＞0.05）。见图3。

2.4 不同时间点低浓度FLC 对AmB 抗菌能力具有不同影响

平板复苏结果显示，不同时间点加入低浓度FLC（0.06、0.03 μg/mL）对AmB 抗菌能力具有不同影响。使用AmB 处理真菌后立即以及6 h 后加入低浓度FLC（0.06、0.03 μg/mL），真菌的数量均减少，而在2、4 h 加入低浓度FLC，在AmB 杀菌浓度（1 μg/mL）下，真菌的数量与单独使用AmB 时效果相似。见图4a。

菌落计数实验结果显示，在0 h 加入低浓度FLC，各组菌落计数倍数无统计学差异（F＝0.27，P＝0.775）；在2 h 加入等量FLC，各组菌落计数FC值差异显著（F＝439.71，P＜0.001）；4 h 加入等量FLC 结果与2 h 一致（FC＝1.74～1.93，F＝141.58，P＜0.001）；在6 h 加入等量FLC，各组菌落计数无明显差异（FC＝1.03～1.16，F＝1.55，P＝0.286）。以上结果证明在2 h 与4 h 低浓度FLC 均可降低AmB 抗真菌性能。见图4b。

以FLC 浓度（0、0.03、0.06 μg/mL）分组评价其作用效果的时间依赖性。各时间点加入0 μg/mL FLC 对菌落计数未见显著差异（FC＝0.84～1.09，F＝1.05，P＝0.422）。2、4 h 加入0.03 μg/mL FLC，菌落计数与0 h 加入时显著升高（2 h：FC＝1.77-1.84，F＝1354.38，P＜0.001；4 h：FC＝1.74～1.93，F＝216.10，P＜0.001），而6 h 时与0 h 加入相比无显著差异（FC＝1.03～1.12，F＝7.12，P＞0.05）。加入0.06 μg/mL FLC 结果与加入0.03 μg/mL 相似，FLC 对AmB 的抗真菌性能影响表现出明显的时间依赖性（F＝289.92，P＜0.001）。见图4c。

Figure 3 Low concentrations of AmB showed no effect on the antifungal activity of FLC at different time points图3 不同时间点低浓度AmB 对FLC 无相互作用

3 讨 论

白色念珠菌是人类最主要、致病率最高的机会性致病真菌，可导致念珠菌血症等严重疾病，即便予以抗真菌治疗，其病死率也高达40%［11］。白色念珠菌是一种双相菌，酵母相和菌丝相之间自由转换的能力是其最常被研究的毒力因素之一［12］。Khodavandi 等［13］检测FLC 与AmB 联合应用下白色念珠菌生物膜形成情况，通过XTT 实验及结晶紫染色发现二者联合应用可抑制白色念珠菌酵母相向菌丝相转化，这一现象在Khodavandi 等对热带念珠菌的相关实验中也得到了证实［8］，同时在Kawai 等通过实时成像技术对AmB 与热带念珠菌的抗菌效果研究中发现，AmB 可在早期（6 h 以内）有效抑制其增殖，而6 h 后给药仅能抑制生物膜进一步生长而不能杀灭念珠菌［14］，提示AmB 的作用效果具有时间依赖性，与本实验研究结果一致。

本实验结果证明了AmB 与FLC 的相互作用具时间依赖性。当这两种药物联合使用时存在以下情况，AmB 处理2 h 内，低浓度FLC 对AmB 作用无显著影响，但有降低趋势；但2 h 到4 h 过程中，低浓度FLC 会显著降低AmB 杀菌效果；然而，在6 h后，低浓度FLC 对AmB 的抗真菌活性无影响。然而，低浓度AmB 对FLC 的作用效果并没有影响。这一差异可能是由于两种药物作用的时效关系引起。Mansfield 等［15］通过H3标记标记FLC 以检测FLC 的药物分布与时间之间的关系，发现FLC 可在3 h 内呈线性快速实现广泛的分布，作用迅速，因此证明FLC 可快速实现对白色念珠菌的麦角甾醇合成的抑制［9］。同样，Khan 等［16］通过检测AmB 对白色念珠菌杀菌曲线，发现其在2～4 h 菌落计数下降最为明显，提示在2～4 h 这一时间段系AmB与靶点结合率达到稳定，是主要发挥作用的时间段。此外，Oliveira 等［17］通过制作杀菌曲线，发现AmB 可在6 h 内快速实现对部分隐球菌的杀灭，这一作用时间在热带念珠菌的研究过程中也得到证实，而6 h 后给药仅能抑制生物膜形成，却无法进步一杀灭残留念珠菌［14］，以上提示AmB 系快速杀菌类抗真菌药物，其可在6 h 内快速发挥抗真菌效果，而6 h 后可能由于作用靶点麦角甾醇与AmB 的结合达到饱和，多数麦角甾醇已被破坏，因此，靶点的缺失导致AmB 无法继续发挥效果。因此，在不同时间点，加入低剂量FLC 可表现出对AmB 抗真菌效能不同的影响。在临床抗真菌治疗应用过程中，若两种药物到达感染部位的时间出现差异，尤其是在2～4 h 这一时间窗口，可能会导致该两种抗真菌药物存在拮抗效应，导致药物抗真菌能力降低。

Figure 4 Low concentrations of FLC had different effects on the antifungal activity of AmB at different timepoints图4 不同时间点低浓度FLC 对AmB 抗真菌能力具不同影响

综上所述，AmB 与FLC 联用具有时间依赖性，早期联用无相互作用，在2～4 h 低浓度的FLC 可减弱AmB 的杀菌效果，该相互作用在6 h 后消失。在治疗念珠菌感染过程中，需谨慎考虑不同抗真菌药物作用窗口时间，避免药物拮抗作用，对进一步促进多烯类与氮唑类药物相互作用的理解及其各自对真菌的关键作用机制具重要意义。