益气活血类中药对精索静脉曲张动物模型生精细胞凋亡干预作用实验研究的Meta分析*

蒋 越，蒙帅杰，买鹏宇，陈 露，郑翼驰，陈 六，王权胜

（1.广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530001）

精索静脉曲张（varicocele，VC）是男科临床常见疾病之一，多见于青壮年男性，因其相关的阴囊疼痛不适、不育与睾丸萎缩等，尤其是对生育的影响，受到广泛关注。VC具体指精索内蔓状静脉丛出现异常扩张、伸长和迂曲的微血管病变，可导致阴囊持续坠胀疼痛及进行性睾丸功能减退，为男性不育症的常见原因之一[1-3]。目前，治疗VC导致不育症的措施不仅仅是手术，还包括药物和辅助生殖技术，而且3种治疗方法还可以彼此协同[4]。研究表明[5-6]，VC可导致睾丸内生精细胞凋亡，增加生精细胞凋亡异常，出现局部微循环障碍。中医药多采取益气活血立法并取得了较好的疗效，但对其具体疗效机制尚未完全阐述清楚。动物实验系统评价被认为在一定程度上提高了动物实验对临床研究的指导水平，且有助于减少其结果向临床转化时的风险[7]。为进一步明确中医药治疗VC的研究机制，本研究以益气活血类中药为案例，采用Meta分析方法对益气活血类中药干预实验性VC动物模型生精细胞凋亡进行探讨，以期进一步验证益气活血类中药治疗VC机制的确切性，为后续研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 检索策略计算机检索中国知网（CNKI）、重庆维普中文科技期刊数据库（VIP）、万方数据知识服务平台（WFPD）、中国生物医学文献数据库（CBM），分别以精索静脉曲张、筋疝、筋瘤、不育、中医、中药、中医药、中药复方、益气活血、中西医结合、汤药、草药、左肾静脉缩窄术、动物模型等为关键词或主题词检索以上中文数据库。以Varicocele、Varicocele infertility、Experimental Varicocele、Chinese Traditional Medicine、Traditional Chinese Medicine、Herbs、Medicinal herbs、Supplement qi and activate blood、Left renal vein ligation、Animal model等为检索词，英文数据库检索PubMed、Embase和Cochrane Library等。所有检索运用MeSH主题词、自由词与布尔逻辑运算连接词相结合的方式，采取组配、后缀、截词等限定检索功能，并反复完善预检索，以确定检索表达式，对不同数据库进行数据转换。检索时限均为从建库至2019年10月1日。

1.2 纳入标准

1.2.1 研究对象 实验性精索静脉曲张动物（大鼠、小鼠）模型，不局限于动物模型的构建模式，设计类型为随机对照实验。

1.2.2 干预措施 中药组给予益气活血类中药干预，不限于益气活血类中药给药方式与剂型；模型组采用造模成功后等量对照溶液。所有动物均无联合用药，且整体实验初始时间、实验周期不限。

1.2.3 观察指标（1）精子密度；（2）精子活率；（3）精子活力；（4）B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）；（5）凋亡因子（Fas）；（6）凋亡因子配体（FasL）；（7）凋亡指数（AI）；(8)Johnson评分。

1.2.4 语种限制 中文及英文。

1.3 排除标准（1）临床研究及综述类文献；（2）离体实验研究；（3）实验数据从文中无法提取或实验结果由于采用图示而无法获取其具体数据，且联系原作者未能全面提供数据信息，无法开展整理分析的文献研究；（4）干预措施中出现非益气活血类中药治疗，如西药、针灸等；（5）重复发表的文献，根据文献信息保留至少1篇研究纳入Meta分析；（6）文献中精索静脉曲张模型合并其他基础疾病；（7）实验分组中无对照组的实验研究；（8）会议论文及摘要。

1.4 文献提取由2名具备实验研究专业基础知识的研究评价员进行独立资料提取，包括论文第一作者、发表时间、动物种类品系、性别、样本量、造模方法、药物剂量、干预措施及相关结局指标等，并进行交叉核对。

1.5 风险评估虽然目前尚未有动物实验注册中心或访问查询研究计划书公开发表数据库，但SYRCLE动物实验偏倚风险评估工具仍然将选择性结果报告作为其条目之一，且其涵义与Cochrane偏倚风险评估工具内容相符[8]。本研究采用SYRCLE动物实验偏倚风险评估工具推荐的6大类偏倚类型共10个细则进行评估：选择性偏倚（序列产生、基线特征、分配隐藏）；实施偏倚（动物安置随机化、盲法）；测量偏倚（随机性结果评估、盲法）；失访偏倚（不完整数据报告）；报告偏倚（选择性结果报告）；其他偏倚（其他偏倚来源）。评估结果中低风险偏倚、高风险偏倚和不确定风险偏倚分别以“是”“否”与“不确定”代表[9]。

1.6 统计学方法采用Cochrane协作网的RevMan 5.3软件进行Meta分析。计量资料以标准化均数差（SMD）或均数差（MD）作为合并效应量，各效应量均采用95%可信区间（CI）表示。运用χ2检验分析各实验研究之间的异质性，若P＞0.10且I2＜50%时，采用固定效应模型进行Meta分析；若P≤0.10和/或I2≥50%时，应先分析异质性产生的原因，并采用亚组分析或敏感性分析等方式进行数据处理，若仍无法消除异质性资料，可谨慎使用能进行合并分析的随机效应模型。Meta分析的检验水准为α=0.05。最后，绘制漏斗图对纳入文献的偏倚程度进行评价分析。

2 结 果

2.1 文献筛选结果共检索出中文文献853篇，英文文献238篇，共1 091篇。剔除重复文献432篇，阅读文题及摘要筛除临床研究、综述、离体实验研究文献共521篇，阅读全文剔除干预措施中出现非益气活血类中药治疗、无对照组实验、合并其他基础疾病、实验研究指标及数据不明确、会议论文、同一文献重复发表共123篇，最终纳入文献15篇[10-24]，所有研究均在中国进行，均以中文形式发表。具体文献筛选流程见图1。

图1 文献筛选流程及结果

2.2 文献基本特征纳入的所有研究为随机对照实验，且均在建模成功后给药，共15篇[10-24]。10项研究[10,13,16,18-24]采用SD大鼠建立VC动物模型，5项研究[11-12,14-15,17]采用Wistar大鼠建立VC动物模型。所有研究造模方式均结扎部分左肾静脉，观察疗程为1~3个月，结局指标有精子密度、精子活率、精子活力、Bcl-2、Fas、FasL、AI、Johnson评分。所有纳入研究的文献基本特征详见表1。

表1 15篇益气活血类中药对精索静脉曲张动物模型生精细胞凋亡干预作用实验研究文献基本特征

2.3 文献质量评价15项研究中仅有7篇文献均采用随机数字表法，其余实验研究中动物是否被随机分配存在着不确定因素。经筛查所有研究后得知，针对动物基线特征、动物研究计划书报告及益气活血类中药干预后模型评估报告充分，但在分配隐藏、盲法研究等内容报告不充分，且无法判定存在其他偏倚，故不足以明确其潜在偏倚风险，具体见表2。

表2 15篇益气活血类中药对精索静脉曲张动物模型生精细胞凋亡干预作用实验研究文献文献质量评价结果

2.4 Meta分析结果为系统比较不同剂量下益气活血类中药对VC动物模型结局指标的干预作用，根据纳入的15篇文献研究设定亚组分析，分别为低剂量组（0.5~0.7 g/mL）、中剂量组（1.0~1.2 g/mL）和高剂量组（1.4~2.4 g/mL）。鉴于精子活力、Fas、FasL、Johnson评分指标纳入文献较少，故未进行敏感性分析。对其余各项指标进行敏感性分析，结果显示，各指标的敏感性分析与原结果相同，且有较好的稳定性。（见表3）

表3 15篇益气活血类中药对精索静脉曲张动物模型生精细胞凋亡干预作用实验研究中结局指标Meta分析结果

2.4.1 精子密度8项研究[10,13,16,19-23]报告了精子密度水平。随机效应模型中Meta分析结果示，益气活血类中药可提升实验后雄性模型大鼠的精子密度[SMD=2.63，95%CI（1.95，3.32），P＜0.000 01]。本研究进一步显示，高、中、低剂量组分别与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.000 01）。

2.4.2 精子活率7项研究[10,13,16-17,19,21-22]报告了精子活率水平。固定效应模型中Meta分析结果示，益气活血类中药可提高实验后雄性模型大鼠的精子活率[SMD=2.38，95%CI（1.87，2.88），P＜0.000 01]。本研究进一步显示，高、中、低剂量组分别与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.000 01）。

2.4.3 精子活力2项研究[13,23]报告了精子活力水平。固定效应模型中Meta分析结果示，益气活血类中药可逐渐增强实验后雄性大鼠的精子活力[SMD=2.88，95%CI（2.38，3.38），P＜0.000 01]。本研究进一步显示，高、中、低剂量组分别与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.000 01）。

2.4.4 Bcl-2 4项研究[10,14-15,23]报告了Bcl-2水平。随机效应模型中Meta分析结果示，益气活血类中药可有效促进实验后雄性模型大鼠的Bcl-2表达水平，进而抑制生精细胞凋亡[SMD=1.29，95%CI（1.02，1.57），P＜0.000 01]。本研究进一步显示，高、中、低剂量组分别与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

2.4.5 Fas 2项研究[10,15]报告了Fas水平。固定效应模型中Meta分析结果示，益气活血类中药可在一定程度上降低实验后雄性模型大鼠的Fas表达水平，继而有效控制生精细胞凋亡进程[SMD=-0.90，95%CI（-1.26，-0.54），P＜0.000 01]。本研究进一步显示，高、中剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.000 1）。低剂量组分别与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4.6 FasL 2项研究[10,15]报告了FasL水平。随机效应模型中Meta分析结果示，益气活血类中药可在一定范围内减少实验后雄性模型大鼠的FasL表达水平，从而延缓生精细胞凋亡[SMD=-2.74，95%CI（-3.55，-1.94），P＜0.000 01]。本研究进一步显示，高、中、低剂量组分别与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.0001）。

2.4.7 AI 5项研究[11-14,24]报告了AI。文献[12]与文献[14]为同一作者相同实验，AI指数数据一致，故纳入其中1项研究的AI指数。随机效应模型中Meta分析结果示，益气活血类中药可下调实验后雄性模型大鼠的AI[SMD=-1.53，95%CI（-1.88，-1.19），P＜0.000 01]。本研究进一步显示，高、中、低剂量组与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.000 01）。

2.4.8 Johnson评分2项研究[18-19]报告了Johnson评分。随机效应模型中Meta分析结果示，益气活血类中药可有效提高实验后雄性模型大鼠Johnson评分[SMD=0.46，95%CI（-1.35，2.26），P=0.01]。本研究进一步显示，高剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P=0.34）。中剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P=0.01）。

2.5 文献发表偏倚根据益气活血类中药对模型组精子密度、精子活率两项结局指标绘制漏斗图，分别以纳入研究的标准化均数差SMD值为横坐标，标准误SE为纵坐标。其中精子密度指标属于随机效应模型，故制作倒漏斗图；精子活率指标属于固定效应模型，故制作漏斗图。图2示，精子密度水平倒漏斗图基本不对称，可能存在一定偏倚；图3示，精子活率水平漏斗图稍不对称，提示进行Meta分析结果可靠性较高。

图2 精子密度变化的倒漏斗图

图3 精子活率变化的漏斗图

3 讨 论

近年来，VC导致不育的关键细胞分子机制为睾丸内生精细胞凋亡及凋亡异常增加，然而生精细胞凋亡在正常的生精过程中是存在的，以适当维持支持细胞与生精细胞的数量平衡，并清除过多及DNA损害严重的生精细胞[25]。调控凋亡因子在精子发生过程中起到一定作用，Johnson评分与凋亡指数（AI）也可以体现凋亡因子与生精功能障碍存在相关性[26-27]。目前，相关研究表明由细胞膜上死亡受体（death receptor，DR）介导的死亡受体通路是细胞凋亡的重要机制，Fas、Fas配体（FasL）蛋白是该途径的核心蛋白，能直接反映凋亡的状态[28-29]。其次，有研究指出凋亡蛋白Bcl-2在成熟精子中具有强阳性的表达，并对凋亡有抑制作用[30]。通过VC模型模拟临床发病，采取部分结扎左肾静脉的方式建立VC模型，探究下游相关细胞凋亡是当前对于生精细胞功能研究的主要途径。目前，有学者运用数据挖掘探讨VC中医治法规律时发现，治以活血化瘀为主，兼以调理气血，调节各脏腑功能[31]。另有研究指出益气活血类中药对于局部微循环改善有较好的调节作用，并对凋亡因子的调节也有一定程度的影响[32-34]。本研究结果显示，与模型组比较，益气活血类中药能够有效提高精子密度、精子活率、精子活力、Bcl-2蛋白水平，降低Fas、FasL、AI，改善Johnson评分。此外，不同剂量的益气活血类中药对模型大鼠Bcl-2、Fas、AI和Johnson评分的影响存在疗效差异，体现了一定的量效关系。

本研究存在以下局限：（1）尽管本研究纳入了精子密度、精子活率等8个结局指标的文献，但受纳入文献质量与数量因素的影响，尚不能系统全面地评价益气活血类中药干预VC模型的疗效水平；（2）纳入研究中出现重复数据，体现当前此项研究具有团队单一、靶点单一、指标单一的特点，这对分析结果的推广造成不利影响；（3）其他作用类中药亦对VC模型生精细胞凋亡具有较好疗效，但本研究仅收集纳入文献中较具有代表性的益气活血类中药，在一定程度上Meta分析结果存在偏倚；（4）由于诸多研究者在中药及复方干预实验中对动物实验系统评价方法认识存在不足，继而可能存在较高的异质性及潜在的偏倚风险，也导致相关文献（含英文）因未提供具体指标数据而不得纳入；（5）目前尚未见有关中药干预VC模型的Meta分析及系统评价，故本研究对文中部分指标评价具有一定的风险差异。

综上所述，现有相关证据表明，益气活血类中药可有效提高VC模型睾丸及附睾组织精子密度、精子活率、精子活力、Bcl-2表达水平，并降低Fas、FasL、AI，改善Johnson评分。但纳入的研究尚存在一定的方法学缺陷，还有待高质量的随机对照研究来予以验证。