静顺汤对抑郁模型大鼠行为学及海马单胺神经递质水平的影响*

郑若韵，贺 娟，熊为锋，王 旭，王冉然，郝 宇

（北京中医药大学中医学院，北京 100029）

五运六气理论是中医学“天人合一”整体观思想的集中体现。运气理论认为疾病的发生受到天地气化的影响。抑郁症是一种复发率高、对患者生活影响极大的精神类疾病[1]，根据世界卫生组织2017年数据显示，全球抑郁症发病率占总人口的4.3%，患病人数已经达到3.22亿，我国抑郁障碍患病率为4.2%[2]，严重威胁人类健康。抑郁症属于中医学“郁证”的范畴。《素问》运气七篇大论中记载了干支运气与郁证发生相关，如《素问·五常政大论篇》言：“太阳司天，寒气下临，心气上从，……喜悲数欠。”且有研究证实抑郁症患者存在明显的五运六气禀赋特征[3]，抑郁症发病具有明显的五运六气时间规律[4]。

《黄帝内经》不仅强调分析病机要重视运气，而且在《素问》七篇大论中提出了基于运气理论的诸多治则，如《素问·六元正纪大论篇》提出五运之气郁而不发时的治疗法则，“木郁达之，火郁发之，土郁夺之，金郁泄之，水郁折之”。《素问·至真要大论篇》则提出六气司天、在泉时的药味组方原则，如“诸气在泉，风淫于内，治以辛凉，佐以苦，以甘缓之，以辛散之。热淫于内，……；司天之气，风淫所胜，平以辛凉，佐以苦甘，以甘缓之，以酸泻之。热淫所胜，……”等，但遗憾的是有其法而无其方。宋代陈无择对此进行了完善与发展，他根据《内经》的理论法则创立十六首运气方。运气方应用于临床，多有奇效，成为历代医家指导临床用药的圭臬。但是，目前关于运气方的研究多为临床个案验案的报道[5-6]，动物实验研究仍属空白，导致运气方临床疗效的科学性难以证实，也限制了运气方的应用推广。

静顺汤出自陈无择《三因极一病证方论》卷五，为辰戌之年，太阳寒水司天、太阴湿土在泉，全年寒湿之气较重而设，具有温阳散寒除湿之功。本研究开展于2018年（戊戌年），从动物实验水平观察运气方静顺汤改善慢性不可预知温和应激（CUMS）联合孤养大鼠模型的抑郁行为的效果，并探讨其作用机制，从而挖掘运气理论对于临床诊疗的重要价值，为运气方静顺汤的临床使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物8周龄SPF级雄性SD大鼠30只，体质量180~220 g，购于北京斯贝福实验动物技术有限公司，动物合格证号：11401500044265，动物许可证号：SCXK（京）2016-0002。饲养于北京中医药大学SPF级动物房，12 h昼夜循环，室温恒定在22~24℃，相对湿度55%~65%。动物的饲养和使用符合国际动物伦理法，并经北京中医药大学动物伦理委员会批准，批准号：bucm-4-2019030507-1046。

1.2 药物与试剂静顺汤方剂组成：白茯苓30 g，木瓜干30 g，炮附子10 g，怀牛膝10 g，防风10 g，炙甘草15 g，干姜15 g，诃子10 g。柴芩温胆汤方药组成：柴胡12 g，黄芩12 g，清半夏9 g，竹茹10 g，茯苓15 g，枳实12 g，陈皮15 g，炙甘草9 g。以上中药饮片均购自北京同仁堂（亳州）饮片有限责任公司，经北京中医药大学中药学院专家鉴定合格。盐酸氟西汀（Patheam France，礼来苏州制药有限公司分装，批号：H20170003，规格：20 mg/粒）。单胺类神经递质标准品：去甲肾上腺素（NE，批号：088K1147）、肾上腺素（E，批号：108K0930）、多巴胺（DA，批号：062426ED）；3，4-二羟基苯乙酸（DOPAC，批号：1364209 22509196）、高香草酸（HVA，批号：107K5002）、5-羟色胺（5-HT，批号：028K5152）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA，批号：1413645 14608169）（Sigma-Aldrich公司）；内标：3，4-二羟苄胺（DHBA，Sigma-Aldrich公司，批号：04429MO）；色谱级甲醇（Fisher，批号：186358）；L-半胱氨酸（Amresco公司，批号：20120928）；磷酸二氢钠（Merck公司，批号：C10095211）；辛烷磺酸钠（批号：T23B035）、乙二胺四乙酸二钠（批号：G05R019）、氯化钾（批号：J23R026）（Alfa Aesar公司）；蔗糖（上海国药试剂，批号：20181010，500 g/瓶）。

1.3 主要仪器Agilent 1100LC型高效液相色谱仪，包括G1379A型脱气机、G1311A型色谱泵、G1313A型自动进样器、G1316A型柱温箱（美国Agilent公司）；DECADEⅡSDC型电化学检测器，包括玻璃碳工作电极、Ag/AgCl参比电极、工作站（Clarity CHS）（荷兰ANTEC公司）；Biofuge Stratos高速冷冻离心机（德国HERAEUS）；VCX130型超声破碎仪（美国SONICS）。

1.4 分组大鼠在符合SPF级标准的实验室适应饲养1周后，对大鼠的糖水基线进行测试，筛选出基线均衡大鼠30只，随机分为空白组、模型组、氟西汀组、柴芩温胆汤组、静顺汤组，每组6只。

1.5 造模与给药本实验采用慢性不可预知温和应激（CUMS）联合孤养方法复制抑郁大鼠模型[7]。除空白组外，其余各组大鼠1只/笼孤养，接受CUMS造模刺激42 d，即根据实验室条件，选取以下7种温和刺激：（1）冰水游泳（4℃，5 min）；（2）束缚（3 h）；（3）禁水（24 h）；（4）禁食（24 h）；（5）夹尾（1 min）；（6）昼夜颠倒（颠倒昼夜顺序，08:00:00—20:00:00模拟黑夜，20:00:00—08:00:00模拟白昼）；（7）45°笼具倾斜（24 h）。为避免大鼠产生应激刺激的耐受性，造模期间，每天随机施加1种刺激，每种应激不在连续的2 d内重复出现。7 d为1个周期，共6个周期，即造模时间为42 d。空白组大鼠6只/笼群养，自由摄食、饮水，不给予任何刺激；大鼠造模的同时药物干预，治疗各组于造模后30~60 min灌胃给药。

1.6 实验给药静顺汤和柴芩温胆汤复方按照传统中药煎煮方法水煎煮2次，每次30 min，合并煎液，水煎浓缩至200%（相当于生药2 g/mL），4℃冰箱冷藏备用。盐酸氟西汀胶囊临用时用去离子水配成0.3 mg/mL的药液。

大鼠灌胃给药量按照成人平均体质量60 kg换算成大鼠的等效药物剂量（大鼠给药量=成人剂量×6.17/60 kg×大鼠体质量）。氟西汀组大鼠灌胃给予氟西汀混悬液，2.057 mg/kg；柴芩温胆汤组大鼠灌胃给予柴芩温胆汤，9.667 g/kg；静顺汤组大鼠灌胃给予静顺汤13.368 g/kg；空白组、模型组大鼠灌胃给予等量去离子水，各给药组大鼠每天固定时间灌胃，1次/d，连续给药42 d。每7 d测量一次大鼠体质量，根据体质量变化更新灌胃剂量。

1.7 观察指标

1.7.1 糖水偏好实验 在实验开始前，训练所有大鼠使其适应含1%蔗糖饮水，进行糖水基线测试和筛选，剔除不能获得稳定的糖水偏好值或未表现出糖水偏好的大鼠。分别于实验开始前1天（0 d）、实验开始后第7天（7 d）、第14天（14 d）、第21天（21 d）、第28天（28 d）、第35天（35 d）、第42天（42 d）进行糖水偏好实验，计算大鼠的糖水消耗、纯水消耗、总液体消耗和糖水偏好指数。糖水偏好指数=（糖水消耗/总液体消耗）×100%，比较分析给药前后各组大鼠糖水偏好指数的差异。

1.7.2 海马单胺神经递质NE、DA、5-HT的测定 采用高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）测定海马单胺神经递质NE、DA、5-HT的含量。在完成各项行为学检测后以断头法处死大鼠，快速取脑置于冰上剥离海马。称质量后加入组织裂解液（0.2 mol/L高氯酸，0.01% L-半胱氨酸，0.5 mmol/L EDTA-2Na），每10 mg组织加入50 μL裂解液，冰浴超声破碎10 s。4℃、15 000 r/min离心30 min，取上清液-80℃冻存以析出蛋白，检测前再以15 000 r/min离心30 min，取上清液用0.22 μm耐酸过滤器过滤，取20 μL进样检测。

色谱条件：色谱柱为Skyam C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相为磷酸二氢钠100 mmol/L，辛烷磺酸钠0.74 mmol/L，乙二胺四乙酸钠0.027 mmol/L，氯化钾8 mmol/L，甲醇8%，pH值为3；流速为0.2 mL/min；柱温为30℃；进样量为20 μL；测定电极电势为500 mV。检测海马单胺类神经递质包括去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、多巴胺（DA），以及代谢产物3，4-二羟基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）。各神经递质含量以ng/g脑组织湿质量表示。

1.8 统计学方法采用SPSS statistics 24.0软件进行统计分析，数据进行正态性检验，服从正态分布的计量资料的多组间均数总体差异的比较采用单因素方差分析，满足方差齐性时多组间均数的两两比较采用LSD法，不满足方差齐性时多组间均数的两两比较采用Dunnett T3法。不服从正态分布的数据采用非参数检验。P＜0.05时为差异有统计学意义。统计图采用GraphPad Prism 7.0软件进行绘制。

2 结 果

2.1 各组大鼠糖水偏好比较造模前（0 d），各组大鼠的糖水偏好比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；第28天（28 d），与氟西汀组、柴芩温胆汤组比较，静顺汤组大鼠糖水偏好指数明显升高（P＜0.05）；第35天（35 d），与模型组比较，柴芩温胆汤组和静顺汤组大鼠糖水偏好指数明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。第42天（42 d），与空白组比较，模型组大鼠糖水偏好指数明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，氟西汀组、柴芩温胆汤组、静顺汤组大鼠糖水偏好指数明显升高（P＜0.01）；与氟西汀组比较，柴芩温胆汤组、静顺汤组大鼠糖水偏好指数明显升高（P＜0.01）。（见图1）

图1 各组大鼠不同时段糖水偏好指数比较（±s，n=6）

2.2 各组大鼠海马单胺类神经递质及代谢产物含量比较

2.2.1 NE及代谢产物E的变化 与空白组比较，模型组大鼠海马NE含量明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，氟西汀组、柴芩温胆汤组、静顺汤组大鼠海马NE含量明显升高（P＜0.01或P＜0.05）。各组大鼠海马E含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图2～3）

图2 各组大鼠海马NE含量比较（±s，n=6）

图3 各组大鼠海马E含量比较（±s，n=6）

2.2.2 DA及其代谢产物DOPAC、HVA含量的变化 与空白组比较，模型组大鼠海马DA及DOPAC、HVA含量有降低趋势但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，柴芩温胆汤组大鼠海马DA含量明显升高（P＜0.05），其余给药组大鼠海马DOPAC、HVA均有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图4～6）

图4 各组大鼠海马DA含量比较（±s，n=6）

图5 各组大鼠海马DOPAC含量比较（±s，n=6）

图6 各组大鼠海马HVA含量比较（±s，n=6）

2.2.3 5-HT及其代谢产物5-HIAA含量的变化 与空白组比较，模型组大鼠海马5-HT、5-HIAA含量明显降低（P＜0.01或P＜0.05）；与模型组比较，静顺汤组海马5-HT含量明显升高（P＜0.01）。（见图7~8）

图7 各组大鼠海马5-HT含量比较（±s，n=6）

图8 各组大鼠海马5-HIAA含量比较（±s，n=6）

3 讨 论

抑郁症患者主要表现为情绪低落、兴趣丧失、思维迟缓和认知障碍。CUMS联合孤养能较好地模拟临床抑郁症的行为和生理症状，是目前较为公认的抑郁症动物模型。本研究沿用了经典的造模方法即CUMS联合孤养，并通过糖水偏好实验来评价该模型大鼠的抑郁情况[8]。其中边造模边给药的方法，即在CUMS期间应用药物进行干预，模拟了药物对抑郁症的发病和进展的预防和治疗作用，相比造模后筛选成功模型入组再治疗的方式，更贴合中医临床“治未病”的思想，这种方法为较多实验研究采用[9-11]。结果显示，造模前各组大鼠糖水偏好基线值比较，差异无统计学意义，具有可比性。6周的造模程序导致大鼠的糖水偏好指数明显低于空白组，表明模型复制成功。第28天时，静顺汤组大鼠糖水偏好指数明显高于氟西汀组和柴芩温胆汤组，此时模型组均值低于空白组，但差异无统计学意义，提示静顺汤提高大鼠对奖赏刺激的敏感性的作用优于其他给药组；第35天、第42天时，柴芩温胆汤组、静顺汤组大鼠糖水偏好指数均明显高于模型组，而第42天，柴芩温胆汤组、静顺汤组大鼠糖水偏好指数明显高于氟西汀组，一定程度表明中药在改善抑郁大鼠快感缺失方面优于西药氟西汀，且静顺汤组大鼠糖水偏好指数均值高于柴芩温胆汤组。综合来看，静顺汤更快、更好地改善了抑郁模型大鼠的糖水偏好指数。空白组大鼠糖水偏好指数在42 d的实验过程中波动较大，但无明显上升或下降趋势，可能由于空白组大鼠采用群养的方法，每次进行糖水偏好实验则需改为孤养，大鼠生活环境发生了变化，而其余各组数据的波动可能也与环境因素相关，提示了在将来的实验中应改进设计，严格控制糖水偏好实验的影响因素。

单胺假说是抑郁症发病机制研究中的经典理论之一。研究表明，抑郁症与大脑中、低水平的单胺类神经递质相关，包括5-HT、DA和NE[12-14]。单胺类神经递质传递过程对情绪调节、心理应激反应、自控、动机、驱动力和认知表现等脑回路有重要影响[15]。海马是边缘系统的重要组成部分，对记忆、行为、情绪、学习等起重要的调节作用，也是应激反应的高级调节中枢，慢性应激可损害海马，引起其功能和结构的变化[16]。本研究结果发现模型组大鼠海马NE、5-HT和5-HIAA的含量均低于空白组，与文献报道一致[17-19]。本实验中模型组大鼠DA及代谢产物含量较空白组有降低趋势，但差异无统计学意义。有研究表明，抑郁患者血浆多巴胺代谢产物高香草酸（HVA）和3，4-二羟基苯乙酸（DOPAC）水平明显降低[20]；动物强迫游泳应激后伏隔核中HVA和DOPAC浓度均降低[21]，但也有研究发现CUMS造模后大鼠海马或皮层的DOPAC和HVA的水平明显升高或无明显差异[22-23]。与模型组比较，静顺汤组可显著提高大鼠海马内NE、5-HT的含量，提示静顺汤可能通过增加模型大鼠海马NE、5-HT含量发挥其抗抑郁作用。

临床上柴胡类方常用于精神疾患尤其是抑郁症的治疗，因抑郁症在中医学中归属“郁证”范畴，解郁常伴疏肝，柴胡为要药[24]。柴芩温胆汤即是由名方温胆汤加入柴胡、黄芩而成，具有理气化痰、温胆和胃之功，尤长于改善抑郁症肝郁气滞、痰湿阻遏之证候。因此本实验，将柴芩温胆汤为阳性对照中药。有实验研究表明，柴芩温胆汤能有效改善抑郁症模型小鼠抑郁表现，增加模型小鼠脑组织中的5-HT含量，减少MDA和NOS的损害是其发挥作用的部分机理[25]。本研究发现柴芩温胆汤显著改善了抑郁大鼠的糖水偏好指数，其均值与静顺汤结果接近；柴芩温胆汤明显提高了海马NE、DA水平，其中DA水平均值高于静顺汤组，但差异无统计学意义；其对海马5-HT含量的改变并不明显，分析其原因，可能与本实验研究脑区仅局限于海马有关，推测柴芩温胆汤对不同脑结构的单胺神经递质有不同的干预效应，还需进一步探究。

陈无择的三因司天方是将运气理论应用于临床的较为完善的方药体系。其根据运气七篇大论中关于不同中运、司天、在泉的运气特点，创立了16首针对每年易发疾病的方剂，简称“运气方”。其中静顺汤，主治“辰戌之岁，病身热头痛，呕吐，气郁中满，瞀闷少气，足痿，注下赤白，肌腠疮疡，发为痈疽”。静顺汤方中以防风通行十二经，与炮附子合用以逐表里之寒湿，木瓜酸温入脾之血分，合干姜以温煦太阴，茯苓、牛膝引附子以达下焦，甘草、防风引干姜以入脾土，诃子之酸温，醒脾助运，同时借助其酸敛，将所补之火潜藏下焦，以防僭越伤肺[26]。全方针对寒湿之气而设，而抑郁症是神气失养而表现出的虚损低落之症，“阳气者，精则养神”，正是戊戌年的寒湿之气加重了阳气耗散，更容易表现出低落萎靡之症。另外，本实验开展于2018年11月22日至12月30日，正是六气中终之气的时节，太阴湿土加临太阳寒水，土克水，湿令行，“寒湿交加，民病惨悽”。静顺汤温阳散寒湿，正以此立方，所以能较好地改善抑郁模型大鼠的抑郁状态。

综上所述，具有温阳散寒湿作用的运气方静顺汤对模型大鼠抑郁症状具有较好的改善作用，提高海马的NE、5-HT可能是其发挥抗抑郁作用的机制之一。静顺汤较柴芩温胆汤抗抑郁样行为的作用更明显，一定程度说明了偏于寒湿的运气特点，可能对本年抑郁症大鼠模型的发病有所影响，静顺汤相对于理气化痰之柴芩温胆汤更切中病机。