脓毒症患者外周血T淋巴细胞亚群PD-1表达率的临床研究

李少洪,钟 坚，陈 丹，张 伟，张磊云，余 涛，黄子通

1.东莞东华医院急诊医学科，广东 东莞 523110; 2.中山大学孙逸仙纪念医院急诊医学科，广州 510120

脓毒症的高发病率和高病死率是急危重症领域亟待解决的问题[1]。研究发现，脓毒症患者的非特异性全身炎症反应和特异性免疫功能均下降，免疫抑制及其共抑制分子成为当下研究的热点。有研究表明，共抑制分子尤其是负性共抑制分子的过度表达与患者的病死率及预后显著相关[2]。程序性死亡因子-1(programmed cell death-1,PD-1)是目前广泛关注的一种共抑制分子，PD-1及其配体通过调控多种免疫细胞的功能，参与固有免疫和获得性免疫，对脓毒症患者的严重程度和预后有重要的预测价值[3]。本研究回顾性分析2019年1月—2020年1月东莞东华医院急诊重症监护病房(EICU)或ICU收治的60例脓毒症患者的临床资料，旨在探讨脓毒症患者T淋巴细胞亚群PD-1的表达能否预测疾病的发生发展。

资料与方法

1 一般资料

纳入标准：(1)年龄≥18岁； (2)符合2016年《SSC(拯救脓毒症运动)指南》中脓毒症诊断标准。排除标准：(1)有肿瘤、自身免疫性疾病及原发器官功能障碍； (2)入院前2周使用糖皮质激素或其他影响免疫功能药物； (3)妊娠、哺乳及月经期女性。本研究经医院医学伦理委员会批准(2017DHLLO13)，获得患者或家属的知情同意。

共纳入脓毒症患者60例，其中男性32例，女性28例；平均年龄(59.7±17.7)岁；致伤原因：道路交通伤24例，意外跌伤12例，高处坠落伤7例，挤压伤3例，烧烫伤2例，其他伤12例；感染灶分布：肺部感染14例，泌尿系感染6例，肠道感染2例，肝脓肿5例，胆道感染3例，外科相关腹腔感染21例，创伤后皮肤软组织感染7例，术后肠瘘2例。非脓毒症患者43例，其中男性23例，女性20例；平均年龄(51.7±22.0)岁；致伤原因：道路交通伤18例，意外跌伤9例，高处坠落伤3例，锐器伤5例，烧烫伤1例，其他伤7例；感染灶分布：肺部感染13例，泌尿系感染5例，肝脓肿4例，肠道感染3例，胆道感染5例，外科相关腹腔感染13例。两组患者一般资料比较，包括年龄、性别、住院天数、基础疾病(高血压病、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病等)，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

2 观察指标

实验室指标：血液常规、C反应蛋白(CRP)、生化、凝血功能、炎症指标、降钙素原(PCT)等，由东莞东华医院验科统一检测。以入院24h内的最差指标值评估并记录患者的急性生理和慢性健康评分(APACHEⅡ)和序贯性器官衰竭评分(SOFA)。

3 外周血T淋巴细胞中PD-1的表达及T淋巴细胞功能相关参数的检测

外周血T淋巴细胞中PD-1表达率的检测：(1)分别加入不同的抗体(CD3、CD4、CD8、PD-1)，加入适量(50～100μL)的抗凝全血，充分混匀后室温避光孵育15min； (2)在每一管中加入荧光激活细胞分选器溶血素工作液2mL，低速漩涡混匀，室温避光静置10min； 溶血后以300离心力(单位：×g)离心5min； (3)弃去上清液，加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS)，以300×g离心洗涤5min； (4)弃去步骤(3)上清液，加入200～500μL PBS(依细胞浓度而定)，用流式细胞仪检测(美国BD FACS Canto Ⅱ)，并用FACS DIVA软件(BD公司流式分析软件)，建立相应的获取模板，调好上机条件，将样本上机获取数据，后进入分析模板，制备相应参数的分析图形，经过合适的圈门技术分析目标细胞的相应参数，得到相应的数据结果与分析报告。

4 统计学分析

结 果

脓毒症组APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、PCT、CRP、白介素-6(IL-6)均较高，血红蛋白、血小板、淋巴细胞计数、肌酐、尿素氮、前白蛋白、白蛋白、凝血酶原活性度均较低，差异有统计学意义(P<0.05)。两组CD3+T细胞(%)、CD4+T细胞(%)、CD8+T细胞(%)、CD4+/CD8+比值、PD-1+总表达率、CD4+T淋巴细胞中PD-1表达率比较差异均有统计学意义(P<0.05，表2)。Pearson相关分析结果显示外周血PCT、CD4+T细胞中PD-1、CD8+T细胞中PD-1表达与APACHE Ⅱ评分、SOFA评分呈正相关(r=0.581、0.510；0.522、0.490；0.435、0.422，均P<0.05，表3)。通过多因素Logistic回归分析筛选出影响脓毒症发生的3个独立因素：SOFA评分(OR=2.150)、PCT(OR=2.721)、CD4+T细胞中PD-1表达率(OR=1.257)，均P<0.05(表4)。ROC曲线中曲线下面积(AUC)为[0.770，95%CI(0.680～0.850)，P<0.05]。Youden指数为0.43，最佳截断值为3.77，灵敏度78.33%，特异度65.12%(P<0.05，图1)。

图1 CD4+T细胞中PD-1表达率的ROC曲线

表2 两组患者实验室检验结果及病情严重程度指标比较

表3 PCT、T细胞亚群PD-1表达与APACHE Ⅱ、SOFA评分相关性

表4 影响脓毒症发生危险因素的Logistic回归分析

讨 论

脓毒症是急诊科、重症医学科的常见危重症，病死率高，治疗难度大，其主要机制与免疫失调、失控有关。在脓毒症的病情进展过程中，机体可出现代偿性抗炎反应，继而进入免疫麻痹状态，包括人类白细胞DR抗原(HLA-DR)降低、淋巴细胞表型改变、程序性细胞死亡、抑炎因子表达增加和共抑制分子表达增加等。PD-1是其中一种共抑制分子，PD-1主要包括2个配体：PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，PD-L2主要表达在免疫细胞上，相关研究较少，而PD-L1广泛表达于造血和非造血细胞中，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、胰岛细胞、成纤维细胞和网状细胞[4]。PD-1主要在活化的T淋巴细胞表达，静止期的T淋巴细胞很少表达[5]，当被病原菌等抗原持续刺激时，PD-1表达上调以对抗T淋巴细胞的过度活化[6]。同时，PD-1表达上调可引起淋巴细胞的凋亡，最终出现免疫抑制，从而加重脓毒症患者的病情，加速脓毒症的进展，形成恶性循环[7]。本研究发现，脓毒症组患者外周血PD-1+总表达率(%)10.36(7.89～14.57)明显高于非脓毒症组8.26(5.68～11.70，P<0.05)，其中CD4+T淋巴细胞中PD-1在两组中的表达率分别为(17.00±22.17)%和(14.60±4.58)%，P<0.05。

本研究显示，与非脓毒症组相比较，脓毒症组APACHE Ⅱ评分、SOFA评分均较高，血红蛋白、血小板、淋巴细胞计数、尿素氮、白蛋白均较低，差异有统计学意义。同时，脓毒症组肌酐、PCT、CRP、IL-6较非脓毒症组升高，差异有统计学意义。与非脓毒症组相比，脓毒症组淋巴细胞总数下降，CD4+T淋巴细胞比例上升，CD8+T淋巴细胞比例下降，CD4+/CD8+比值升高，这与康秀文等[8]在腹腔感染致脓毒症患者研究的结果一致。另外Zhang等[9]研究发现脓毒症患者T淋巴细胞表面PD-1表达显著上调可引起T细胞耗竭，表现为T细胞周期阻滞、无法繁殖，合成细胞因子减少，以及诱导CD8+T淋巴细胞死亡，导致其下降。

为了进一步阐明PD-1在脓毒症中的作用，Gao等[10]在一项前瞻、随机、对照临床研究中观察182例脓毒症患者，发现与健康对照组相比，CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD8+CTLA-4+表达水平差异有统计学意义，进一步Logistic回归分析显示CD4+T细胞中PD-1表达率可能是脓毒症的危险因素，CD4+T细胞百分比可能是脓毒症的保护因素。在本研究中，与非脓毒症患者相比，脓毒症患者PD-1+总表达率、CD4+T淋巴细胞中PD-1表达率较高，且多因素Logistic回归分析显示SOFA评分、CD4+T淋巴细胞中PD-1、PCT是影响脓毒症发生的独立因素，并未发现CD4+T细胞百分比的意义，考虑与人群选择、疾病严重程度等不同有关。本研究与Gao等[10]研究均证实了CD4+T细胞中PD-1表达率在脓毒症中的价值。此外，笔者对CD4+T细胞中PD-1表达率在脓毒症中的诊断价值进行分析，ROC曲线下面积为0.770(95%CI：0.680～0.850)，灵敏度和特异度均较高(灵敏度78.33%，特异度65.12%)，P<0.05，CD4+T细胞中PD-1表达率升高可作为脓毒症诊断的重要指标之一。

本文的局限性在于：(1)研究样本量较小，需纳入更多样本量去动态分析指标及观察临床预后结局；(2)脓毒症患者在不同的病程阶段，感染病原体、感染病灶、疾病严重程度不同可能会导致不同的免疫抑制状态，后续研究可在扩大样本量基础上进一步分层分析。

综上所述，CD4+T细胞中PD-1表达率升高是脓毒症发生发展的独立因素之一，具有较高的特异度和灵敏度，可作为脓毒症患者的重要免疫功能监测指标之一。