鲤疱疹病毒Ⅱ型检测技术的研究进展

郭宝琴，魏 畅，李 强

( 1.大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁 大连 116023； 2.盐城工学院 海洋与生物工程学院，江苏 盐城 224051 )

鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyprinidherpesvirusⅡ,CyHV-2)，又称为疱疹造血器官坏死病毒(或金鱼造血器官坏死病毒)，属疱疹病毒目、疱疹病毒科、鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)。由于是第二个分离自鲤科鱼类的疱疹病毒，该病毒被国际病毒系统分类委员会命名为鲤疱疹病毒Ⅱ型[1-2]。该病毒为双链DNA病毒，无囊膜包被的核衣壳呈六角形或球形，囊膜包被下的病毒粒子成椭圆形，大小为175～200 nm[3]。该病毒在中国、日本、美国、澳大利亚、新西兰及欧洲一些国家均有报道，可造成养殖鲫鱼(Carassiusauratus)和金鱼大量死亡。现阶段针对鲤疱疹病毒Ⅱ型的感染尚无有效的防控措施，不能有效地控制该病的暴发，因此，早诊断、早隔离、早防控是控制该病蔓延的有效手段。笔者基于国内外的相关研究进展，就鲤疱疹病毒Ⅱ型的免疫学检测、分子生物学检测、细胞培养分离等检测技术进行了详细的分析与梳理，以期为鲤疱疹病毒Ⅱ型的及早诊断及防控提供借鉴和思路。

1 研究机构分布

随着鲤疱疹病毒Ⅱ型在世界范围内传播，并对金鱼、鲫鱼养殖业造成重大经济损失，国内外研究人员对鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测技术开展了多方面的研究，以期做到病毒的早诊断、早隔离、早防控。目前国内外关于鲤疱疹病毒Ⅱ型检测方法的相关报道共有60余篇，国内授权相关发明专利10余项。国内的研究机构主要有上海海洋大学、中国水产科学研究院、四川农业大学、苏州大学、华中农业大学、南京师范大学、西南大学、南京农业大学、甘肃农业大学等(图1、表1)。世界范围内，除我国外，日本、美国、德国、英国、捷克、法国、波兰、意大利、澳大利亚以及印度等对鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测方法也进行了相关研究(图2)。

图1 国内研究鲤疱疹病毒Ⅱ型检测技术研究机构分布(以发表论文数量进行统计)Fig.1 Distribution of research institutions which have investigated CyHV-2 detection technology in domestic (based on the number of published papers)

表1 国内研究鲤疱疹病毒Ⅱ型检测技术研究机构分布(以授权的发明专利进行统计)

图2 国内外关于鲤疱疹病毒Ⅱ型检测技术相关论文发表统计Fig.2 Statistics of the number of published papers on CyHV-2 detection technology in the worldwide

2 免疫学检测方法

2.1 酶联免疫吸附测定技术

酶联免疫吸附测定(ELISA)技术是利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法，是免疫学中的经典检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、适用于基层等优点。目前，已建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型的酶联免疫吸附测定检测技术主要有两种：双抗夹心酶联免疫吸附测定和间接酶联免疫吸附测定。徐晔等[4]以抗ORF90单克隆抗体作为捕获抗体，酶标抗ORF90多克隆抗体为检测抗体，建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型双抗夹心酶联免疫吸附测定检测技术。该检测方法具有良好的特异性，与鲤春病毒血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、传染性造血器官坏死症病毒、锦鲤疱疹病毒、传染性胰腺坏死病毒、鲑鱼传染性贫血病毒、草鱼出血病病毒等无交叉反应；检测灵敏度高，对40份无临床症状的样本检测发现，夹心酶联免疫吸附测定方法的阳性检出率为45%，而PCR技术的阳性检出率仅为37.5%。此外，以抗ORF25单克隆抗体为检测抗体，以酶标羊抗鼠IgG为二抗，建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型间接酶联免疫吸附测定检测技术。利用该技术对无感染和感染鲤疱疹病毒Ⅱ型银鲫(Carassiusauratusgibelio)的脾脏、鳃、肾脏的总蛋白进行检测，发现鲤疱疹病毒Ⅱ型感染鱼的脾脏、鳃和头肾样品中，酶联免疫吸附测定结果为阳性(P/N值>2.1)，而未感染鲤疱疹病毒Ⅱ型鱼组织检测为阴性(P/N值<2.1)[5]。

2.2 免疫荧光检测技术

3 分子生物学检测方法

3.1 普通PCR检测技术

3.2 双重PCR检测技术

双重PCR是指在同一PCR反应体系里加上两对引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与普通PCR相同，但更为高效、快捷和准确。罗丹等[17]针对鲤疱疹病毒Ⅱ型三联体蛋白基因的两段保守序列作为扩增靶标合成引物，建立了双重PCR检测技术，可特异性扩增出218 bp和369 bp两条目的片段，对鲤疱疹病毒Ⅱ型最低检测限为3×102拷贝/μL，与基于相同基因而建立的普通PCR检测技术(检测限为2×104拷贝/μL)[14]相比，双重PCR检测的灵敏度更高。谢亚君等[18]针对鲤疱疹病毒Ⅱ型解旋酶基因建立的双重PCR检测技术，可特异性扩增出800 bp和250 bp两条目的片段，对鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测限为1.4×104拷贝/μL。对不同地区采集的54尾异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)组织样本进行鲤疱疹病毒Ⅱ型检测，检出率为72.2%。由此可见，鲤疱疹病毒Ⅱ型三联体蛋白基因保守序列更适合作为双重PCR检测技术的扩增标靶。

3.3 巢式PCR检测技术

3.4 实时荧光定量PCR技术

3.5 环介导等温扩增检测技术

环介导等温扩增法是一种新颖的恒温核酸扩增方法，是指针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件保温30～60 min，完成核酸扩增反应。环介导等温扩增是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点，检测成本远低于荧光定量PCR。目前，已建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型环介导等温扩增检测技术主要聚焦于病毒基因序列中较为保守的解旋酶基因[32-36]，不同学者建立的方法、检测时间和灵敏度有所不同，其检测时间最短可在30 min内完成[33-34]，检测灵敏度最高可达10-3拷贝/μL[35]。此外，还建立了针对鲤疱疹病毒Ⅱ型末端酶基因、DNA聚合酶基因和三联体蛋白基因的环介导等温扩增技术，经验证均具有良好的特异性和灵敏度[18,37-39]。Li等[40]针对鲤疱疹病毒Ⅱ型建立了一种环介导等温扩增与横向流动试纸条相结合的一种新颖的检测技术。该检测需在64 ℃下反应60 min，最低的检测限为4.93×104拷贝/μL；特异性强，对鲤疱疹病毒Ⅰ型、锦鲤疱疹病毒、传染性脾肾坏死病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、对虾白斑综合征病毒以及青蟹呼肠孤病毒等多种病毒无交叉反应。该方法耗时相对较长，且灵敏度相对不高，但操作简单，可实现养殖生产中的现场操作。郝贵杰等[41]也建立了一种结合环介导等温扩增和核酸横向测流的检测方法，经验证，此方法对低拷贝病毒样本、保存条件较差的鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA也有良好的检测效果，对冻融次数多达20次的带毒样本依然具有100%的检出率。

3.6 其他分子检测技术

Ding等[42]针对鲤疱疹病毒Ⅱ型建立了基于寡核苷酸探针的鲤疱疹病毒Ⅱ型荧光原位杂交(FISH)检测技术，此技术具有良好的特异性，经验证在43 ℃时荧光强度最大，探针质量浓度在5 ng/μL时获得足够特异的荧光，但探针质量浓度过高(50 ng/μL)，会导致荧光强度增高而特异性降低。Wang等[43]通过制备鲤疱疹病毒Ⅱ型感染鱼样品的外周血细胞涂片，建立了原位杂交技术(ISH)，发现探针与感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的鱼样品相结合呈蓝色反应，而与未感染鱼样品不结合。Yang等[44]根据GenBank中公布的鲤疱疹病毒Ⅱ型和鲤春病毒血症病毒的核苷酸序列信息设计引物，建立了可同时检测鲤疱疹病毒Ⅱ型和鲤春病毒血症病毒的实时荧光定量PCR技术，此方法对两种病毒的最低检测限约为88个拷贝，且具有良好的特异性。齐立斐等[45]以鲤疱疹病毒Ⅱ型基因保守区域片段为靶序列设计特异性引物，建立了一种集核酸快速提取和竞争性互补介导核酸恒温扩增(CAMP)微流控芯片于一体的检测方法，其对鲤疱疹病毒Ⅱ型最低检测限为10 拷贝/μL，与鲤疱疹病毒Ⅲ型无特异性扩增，特异性良好，对89批次样本进行检测，检出率为100%。郝中香等[46-47]分别通过设计合成ORF6基因和DNA聚合酶基因特异性引物及TaqMan探针，建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型微滴式数字PCR(ddPCR)检测技术，对鲤疱疹病毒Ⅱ型最低检测限为3.77拷贝/μL。徐进等[48]根据鲤疱疹病毒Ⅱ型的helicase基因编码序列设计交叉引物，建立了一种交叉引物扩增检测技术，此技术对鲤疱疹病毒Ⅱ型具有良好的特异性；最低检测限为10 拷贝/μL。Wang等[49]针对鲤疱疹病毒Ⅱ型建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术与侧向流动免疫层析(LFD)技术相结合的检测方法。此方法在38 ℃水浴中反应10 min，通过肉眼便可观察到检测结果，对鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测限高达5 pg，比常规PCR技术灵敏度高近百倍，且均不与传染性皮下及造血组织坏死病毒、对虾白斑综合征病毒、草鱼出血病病毒、鲤春病毒血症病毒、锦鲤疱疹病毒等水生病毒发生反应，具有良好的特异性。此外，利用终点PCR技术和重组酶介导扩增(RAA)技术对鲤疱疹病毒Ⅱ型检测，也表现出良好的特异性和灵敏度[50-53]。

4 细胞培养分离技术

5 展 望

众所周知，鲤疱疹病毒Ⅱ型为引起金鱼和鲫鱼造血器官坏死病的病原，此病原给我国鲫鱼养殖产业带来巨大的经济损失。目前，针对鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测国内外建立了免疫学检测技术、分子生物学检测技术、细胞培养分离技术等，这些技术均具有较好的灵敏度和特异性，但需要昂贵的仪器设备以及熟练的技能，比较适用于高技能的实验人员操作，对养殖场等公开场合具有一定的局限性，因此急需建立操作简单、检测快速、适用于现场检测的方法。胶体金免疫层析检测试纸条(CGIS)是一种具有检测速度快、稳定性好、操作简单以及用肉眼即可判断出检测结果的检测方法，其在水生动物多种病原检测中已表现出良好的优越性，但目前仍未有关于鲤疱疹病毒Ⅱ型胶体金免疫层析试纸条相关的技术报道，下一步本实验室将致力于鲤疱疹病毒Ⅱ型胶体金免疫层析试纸条的开发。