lncRNA SNHG15-210通过上调CDKN1A对宫颈癌SIHA细胞增殖的影响

鲍群丽 万淑琼 黄耿 汪宏良 柯俊 尚小玲鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）检验科 45000；鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）妇科 45000；鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）泌尿外科 45000

宫颈癌是世界上女性发病率较高的恶性肿瘤之一，复发率高且较易转移，严重威胁女性健康［1］。研究宫颈癌的发病机制，为宫颈癌治疗提供有效的分子靶点是目前临床和基础研究的热点。长链非编码RNA（lncRNA）是一类非编码单链RNA，长度超过200个核苷酸［2］。lncRNA在肺癌、膀胱癌、宫颈癌、黑色素瘤等各种肿瘤中表达上调或下调，与肿瘤细胞的分化、增殖、侵袭等行为有关［3］。研究发现，SNHG15-210是一种由953个核苷酸组成的lncRNA，其在甲状腺癌中发挥抑癌因子作用［4］。SNHG15-210对宫颈癌细胞的作用尚未明了。本研究主要研究SNHG15-210对宫颈癌细胞增殖的影响及其作用机制，以期为宫颈癌的靶向治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 宫颈癌细胞SIHA购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；CCK-8试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司；DMEM培养基购于美国Gibco公司；pcDNA-NC、pcDNA-SNHG15-210质粒购于上海吉玛制药技术有限公司；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒购于大连宝生物公司；Opti-MEM培养基、Lipofectamine 3000购于美国Life Technologies公司；结晶紫购于美国Sigma公司；一抗、辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G（IgG）二抗购于美国CST公司。

1.2 细胞培养和转染 将SIHA细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱内。将对数生长期SIHA细胞接种于24孔板，根据Lipofectamine 3000试剂说明书将pcDNA-NC、pcDNA-SNHG15-210质粒转染入SIHA细胞，分别记为NC组和SNHG15-210组，转染48 h后检测各组细胞的转染效率。

1.3 qRT-PCR检测SNHG15-210、细胞周期蛋白依赖蛋白激酶抑制剂1A（CDKN1A）信使RNA（mRNA）表达 采用TRIzol试剂提取SIHA细胞RNA，合成cDNA后按照qRT-PCR试剂盒说明书进行反应，引物序列如下。CDKN1A引物正向序列：5’-TGTCCGTCAGAACCCATGC-3’，反 向 序 列：5’-AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC-3’；GAPDH引物正向序列：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 序 列：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；SNHG15-210引物正向序列：5’-GGGACCTGACCTGAGAGAAGAT-3’，反向序列：5’-GGTGCCAAGGCTTGCATTCA-3’。以GAPDH为SNHG15-210和CDKN1A mRNA的内参基因，按照2-ΔΔCt法计算SNHG15-210、CDKN1A mRNA的表达。

1.4 CCK-8法检测SIHA细胞增殖情况 将处理后的SIHA细胞制成单细胞悬液，按照每孔3×103个接种至96孔板，每孔加入25μl CCK-8试剂，培养4 h，于酶标仪检测波长在450 nm处的吸光度（OD）值。每组采用4个复孔，分别在第1天、第2天、第3天、第4天进行CCK-8法检测，实验重复4次。

1.5 集落形成实验检测SIHA细胞增殖能力 将处理后的SIHA细胞制成单细胞悬液，按照每孔3×103个接种至6孔板，培养10 d后，用甲醇溶液固定细胞，用0.1%结晶紫溶液染色，用流水洗去残余染液，观察并计数集落形成数。每组采用4个复孔，实验重复4次。

1.6 Western blot检测CDKN1A蛋白的表达 向处理后的SIHA细胞中加入细胞裂解液，提取总蛋白，取50μg蛋白样品上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳和转膜，用5%脱脂牛奶封闭3 h，分别加入稀释后的一抗孵育过夜，加入IgG二抗孵育2 h，加入ECL显影液显影、拍照。

1.7 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料符合正态分布，均以均数±标准差（±s）表示，组间比较应用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组SIHA细胞中SNHG15-210的表达 如图1，SIHA细胞转染24 h后，NC组和SNHG15-210组SIHA细胞中SNHG15-210的表达分别为（1.14±0.37）和（11.69±2.62），SNHG15-210组相比NC组上调了10.25倍（t＝3.99，P＜0.01）。

图1 NC组和SNHG15-210组中SNHG15-210的表达

2.2 SNHG15-210对SIHA细胞增殖活性的影响 与NC组相比，SNHG15-210组SIHA细胞在第2、3、4天时增殖活性均有下降趋势（均P＜0.05），表明SNHG15-210过表达抑制宫颈癌SIHA细胞增殖活性（图2）。

图2 高表达SNHG15-210对SIHA细胞增殖能力的影响

2.3 SNHG15-210对SIHA细胞集落形成能力的影响 NC组和SNHG15-210组集落形成数分别为（162.30±14.92）个和（61.55±12.31）个，差异有统计学意义（t＝5.21，P＜0.01），提示SNHG15-210过表达可抑制宫颈癌SIHA细胞的集落形成（图3）。

图3 SNHG15-210对SIHA细胞集落形成的影响

2.4 SNHG15-210对CDKN1A mRNA表达的影响 如图4，NC组和SNHG15-210组SIHA细胞中CDKN1A mRNA的 表 达 分 别 为（1.02±0.11）和（6.23±1.16），表 明SNHG15-210可升高CDKN1A mRNA的表达（t＝4.50，P＜0.01）。

图4 SNHG15-210对SIHA细胞CDKN1A mRNA表达的影响

2.5 SNHG15-210对CDKN1A蛋白表达的影响Western blot结果（图5）表明，与NC组相比，SNHG15-210组SIHA细胞CDKN1A蛋白表达增加，细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和Cyclin D2表达降低。

图5 高表达SNHG15-210对SIHA细胞CDKN1A蛋白表达的影响

3 讨 论

研究发现，lncRNA异常表达与宫颈癌的发生、发展密切相关［5］。lncRNA如PTCSC3［6］、PTENP1［7］可通过上调抑癌基因的表达，降低宫颈癌的增殖、迁移和侵袭能力。lncRNA如SOX2OT［8］、EWSAT1［9］可通过上调癌基因的表达，促进宫颈癌的发生和发展。Liu等［4］研究显示，SNHG15-210在甲状腺癌组织和细胞中表达下调，与患者临床分期、肿瘤大小、远处转移相关，SNHG15-210过表达可抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，SNHG15-210在甲状腺癌中起肿瘤抑制作用。SNHG15-210在宫颈癌细胞中的作用尚不明了。本研究显示，过表达SNHG15-210可明显抑制宫颈癌SIHA细胞的增殖能力，SNHG15-210在宫颈癌细胞中表现为抑癌因子作用。

CDKN1A蛋白是一种细胞周期蛋白依赖蛋白激酶抑制剂，通过与细胞周期蛋白依赖蛋白激酶相结合，负性调控细胞周期的进展［10］。CDKN1A蛋白在诱导肿瘤细胞DNA修复、凋亡、衰老等发明发挥重要作用［11］。CDKN1A蛋白在宫颈癌组织中的表达低于癌旁组织，上调CDKN1A基因表达可明显抑制宫颈癌细胞的增殖［12］。本研究显示，过表达SNHG15-210后SIHA细胞中CDKN1A基因表达显著增加，提示SNHG15-210可促进CDKN1A的表达。本研究显示，SNHG15-210促进CDKN1A表达后，SIHA细胞中细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和Cyclin D2表达降低，表明SIHA细胞的增殖活性降低。

综上所述，SNHG15-210可能通过促进CDKN1A基因表达抑制宫颈癌细胞的增殖活性，提示SNHG15-210有望成为宫颈癌治疗的潜在靶点。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。