参芪扶正汤对盆腔炎性疾病后遗症小鼠上生殖道炎症的影响*

刘小月，黄海涛，卜晓玲

北京中医药大学东方医院，北京 100078

盆腔炎性疾病后遗症(sequelae of pelvic inflammatory disease，SPID)是由于女性盆腔炎性疾病未得到及时诊治或治疗失误而导致的[1]，其主要病理表现为组织破坏、粘连、增生、瘢痕生成等[2]，主要症状是反复下腹隐痛、久站及劳累后出现下腹坠胀感、腰骶酸痛及白带异常等，远期将引发不孕、异位妊娠、慢性盆腔痛，甚至SPID急性发作等严重疾病。按发病部位可将SPID归为子宫内膜炎、输卵管慢性炎症、输卵管积水、输卵管卵巢炎、卵巢囊肿、盆腔结缔组织炎等[3]。目前，临床诊治中发现，SPID的慢性盆腔痛症状尤为突出，且有病情顽固、反复不愈、病程迁延的特点，发病率逐年增高[4]，严重影响广大女性生活质量和身心健康。SPID属于无菌性炎症，无明显治疗指征，若滥用抗生素易造成菌群失调甚至二重感染等严重后果，给临床治疗带来严重不便。丹枝饮是北京中医药大学第二临床医学院金哲教授的经验方，方中丹参、桑枝、川芎、续断、连翘、延胡索、香附等中药通过活血化瘀、驱邪以提高机体免疫力。研究显示，丹枝饮可促进盆腔局部血液循环、改善盆腔炎症微环境、提高机体免疫力[5-7]，临床诊治已取得确切疗效。SPID反复发作、难愈成瘀，日久必定耗伤机体正气，因此，在临床治疗中除化瘀外，还应重视扶正。参芪扶正汤是基于金哲教授的经验方丹枝饮加减而来，方中黄芪、党参、白术等中药健脾益气、固护后天正气，配合丹参、赤芍、当归、鸡血藤等中药活血化瘀。气为血之帅，血为气之母，正气存内，邪不可干，正气足，则活血化瘀效果更佳。本研究以SPID模型小鼠为研究对象，以炎症因子IL-8、TNF-α、IL-4、IL-10的表达水平的检测指标，探讨参芪扶正汤对SPID小鼠上生殖道炎症因子的影响。

1 材料

1.1 动物SPF级BALB/c雌性小鼠60只，7～8周龄，体质量20～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-2011，动物合格证：11400700337244。实验动物饲养于北京中医药大学生物安全II级动物房，室温(25±1) ℃，湿度为50%～60%，12 h光照/12 h黑暗循环，自由摄食饮水。该研究经北京中医药大学第二临床医学院伦理委员会批准通过，伦理批号：BUCM-4-2018031201-1017。

1.2 药物与试剂参芪扶正汤(黄芪15 g、党参15 g、当归10 g、白术15 g、丹参10 g、赤芍10 g、鸡血藤10 g、桑枝10 g、延胡索9 g，北京康仁堂有限公司，批号：18000151、18002031、17027701、17024751、17023601、18000981、18001212、17016042、17027761)；阿司匹林肠溶片(阿斯利康制药有限公司，规格：0.5 g·片-1，国药准字：H32026199)。浓盐酸(hydrochloric acid，HCL，国药集团化学制剂有限公司，批号：20180306)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美国Sigma公司，批号：12190801)；羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium，CMC，天津市福晨化学试剂厂，批号：20140715)；孕马血清促性腺素(pregant mare serum gonadotropin，PMSG，宁波第二激素厂商，批号：190723)；RIPA裂解液、30%制胶液(291)、1 mol·L-1Tris-HCL(pH 6.8)、1.5 mol·L-1Tris-HCL(pH 8.8)、4×蛋白上样缓冲液(北京索莱宝科技有限公司，货号：R0020、A1010、T1020、T1010、P1016)；预染蛋白marker(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号：26616)；PVDF膜(0.45 μm，德国Merck Millipore公司，货号：IPVH00010)；增强型ECL试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：E411-04)；GAPDH一抗(美国Bioworld Technology公司，货号AP0063)；IL-4一抗、IL-8一抗、TNF-α一抗(英国Abcam公司，货号：ab9728、ab110727、ab183218)；IL-10一抗(美国Genetex公司，货号：GTX632359)；多克隆二抗(美国KPL公司，货号：074-1506)。

1.3 仪器BSA124S型电子天平(德国Sartorius公司)；DW-60W151EU型-80 ℃低温冰箱、BCD-225SDCW型4 ℃低温冰箱(青岛海尔生物医疗股份有限公司)；AF10型制冰机(美国Scotsman公司)；PL5121型去离子水仪(美国Purelab Plus公司)；X-OMAT BT型医用X射线胶片(美国柯达公司)；5417R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司，离心半径：4cm)；TS-2型转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造公司)；DYCZ-24DN型垂直电泳仪、DYCZ-40DN型转印电泳仪(北京六一仪器厂)。

2 方法

2.1 药物制备取参芪扶正汤组方颗粒剂，加10倍量蒸馏水充分溶解，以常压蒸发浓缩至浓度为0.85 kg·L-1，灌封备用。阿司匹林肠溶片溶于100 mL 37 ℃蒸馏水中，玻璃棒搅拌均匀，使其浓度为10 g·L-1，置于4 ℃冰箱备用。

2.2 分组造模与给药60只雌性BALB/c小鼠随机分为正常组、模型组、阿司匹林(阳性对照药)组、参芪扶正汤灌胃组、参芪扶正汤灌肠组及参芪扶正汤灌胃灌肠联合组，每组10只。适应性喂养后，每只小鼠皮下注射7.5 IU的PMSG，每天1次，连续 2 d。PMSG注射完成24 h后开始造模，除正常组外，每只小鼠以10 mL·kg-1的剂量宫颈内注入1 mol·L-1HCL，然后宫颈注射50 mg·kg-1LPS，每次 100 μL，每2 h注射1次，共注射4次，建立SPID小鼠模型[8]。根据前期实验研究，选用阿司匹林肠溶片作为阳性对照药。造模后第6周开始给药，正常组、模型组给予5‰CMC溶液20 mL·kg-1灌胃；阿司匹林组灌胃20 mL·kg-1阿司匹林肠溶片溶液；参芪扶正汤灌胃组、参芪扶正汤灌肠组分别灌胃、灌肠20 mL·kg-1参芪扶正汤溶液；参芪扶正汤灌胃灌肠联合组灌胃(20 mL·kg-1)及灌肠(20 mL·kg-1)参芪扶正汤溶液，每天1次，连续15 d。

2.3 小鼠脸谱疼痛评分(mouse grimace score，MGS)末次给药后第2天考察小鼠脸谱疼痛评分。单手固定小鼠使其悬空仰伸，取两侧髂前上棘的连线做3等分，在2个等分点上用棉签深压腹部，维持10 s，观察小鼠面部表情变化。依据参考文献进行评分[9]，具体如下：①眼眶收紧：0分(无反应)、1分(轻微)、2分(明显)；②耸鼻尖：0分(无反应)、1分(轻微)、2分(明显)；③鼓起两腮：0分(无反应)、1分(轻微)、2分(明显)；④耳朵位置：0分(无反应)、1分(直立)、2分(后抻)；⑤胡须摆动：0分(无反应)、1分(轻微)、2分(明显)。取两侧评分相加后的总分进行统计学分析，通过MGS间接反应小鼠盆腔疼痛程度。

2.4 SPID小鼠上生殖道组织中IL-4、IL-10、IL-8、TNF-α蛋白表达水平的检测小鼠于脸谱疼痛评分测试后处死，无菌条件下进行解剖，快速取小鼠上生殖道组织(子宫、双侧输卵管及双侧卵巢)，-80 ℃ 低温冰箱保存。取上生殖道组织进行总蛋白提取、含量测定、蛋白样品变性、SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、一抗孵育(11 000)、TBST洗涤、HRP标记的二抗孵育(15 000)、TBST洗涤、显影，最后进行结果分析。

3 结果

3.1 参芪扶正汤对SPID小鼠MGS的影响与正常组比较，模型组MGS显著升高(P<0.05)，提示该造模方法有效可行，SPID可导致小鼠慢性盆腔疼痛。与模型组比较，参芪扶正汤灌胃组、参芪扶正汤灌肠组及参芪扶正汤灌胃灌肠联合组MGS均降低，其中参芪扶正汤灌肠组、参芪扶正汤灌胃灌肠联合组MGS显著降低(P<0.05)。提示，参芪扶正汤可缓解小鼠的盆腔疼痛。见表1。

表1 参芪扶正汤对SPID小鼠MGS的影响 分)

3.2 参芪扶正汤对SPID小鼠上生殖道组织炎症因子蛋白表达水平的影响与正常组比较，模型组小鼠上生殖道组织IL-10、IL-8、TNF-α的蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，而IL-4的蛋白表达水平有升高趋势，但无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，参芪扶正汤灌胃组、参芪扶正汤灌肠组、参芪扶正汤灌胃灌肠联合组小鼠上生殖道组织中抗炎因子IL-4、IL-10的蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；促炎因子IL-8和TNF-α的蛋白表达水平呈现不同程度的降低，其中，参芪扶正汤灌胃组、参芪扶正汤灌胃灌肠联合组小鼠上生殖道组织中 IL-8、TNF-α的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。提示，参芪扶正汤可明显提高SPID小鼠上生殖道组织中抗炎因子的表达水平，明显降低促炎因子的表达水平。见表2，图1。

表2 参芪扶正汤对SPID小鼠上生殖道炎症因子蛋白表达水平的影响

注：1：正常组；2：模型组；3：阿司匹林组；4：参芪扶正汤灌胃组；5：参芪扶正汤灌肠组；6：参芪扶正汤灌胃灌肠联合组图1 Western Blot检测SIPD小鼠上生殖道炎症因子蛋白表达水平

4 讨论

SPID发生时，主要表现为继发于细菌感染后的免疫反应及盆腔组织血运微环境障碍[10]。由于少量浸润的炎症细胞、异常分泌的炎性因子、趋化因子及受体等持续存在，构成SPID盆腔炎症微环境[11]，造成继发病变组织损伤进行性加重，表现为瘢痕、增生、粘连等，最终形成“冰冻”盆腔，导致异位妊娠、不孕、慢性盆腔痛(chronic pelvic pain，CPP)、SPID的急性发作或亚急性发作等并发症的出现。病理观察显示，除淋巴细胞浸润外，可见大量巨噬细胞浸润，且吞噬活性明显增加，激活继细菌感染后的免疫反应，从而引发SPID亚急性或急性发作[12]。研究表明，炎症因子在慢性炎症反应过程中扮演着双重作用，促炎因子可促进炎症反应的发生发展，而抗炎因子则可抑制炎症反应的过度激活。抗炎因子和促炎因子的协调平衡，决定了机体炎症反应的表现和转归[13]。

当机体受到外界炎症入侵时，促炎因子分泌增多，激发机体自我保护的防御机制，促使抗炎因子分泌增多，抵抗体内促炎因子对机体的损伤，使机体内促炎与抗炎平衡，维持免疫稳态。但外界刺激的持续进行，机体促炎因子水平持续升高，导致过度的炎症反应，对细胞本身的功能产生不利影响[14]。盆腔炎性疾病后遗症属于促炎因子与抗炎因子失衡引起的一系列机体不良反应。研究证实，中药可以通过干预机体免疫反应调整炎症因子水平[15]，促使机体抗炎因子与促炎因子的平衡，从而抑制炎症反应，达到治愈疾病的效果。中药灌肠能够有效降低慢性盆腔炎患者TNF-α等促炎因子水平，提高 IL-10 等抗炎因子水平，显著改善炎性因子水平[16]。临床诊疗中，与SPID相关的炎症指标较多，其中关系密切的抗炎因子有IL-4、IL-10，促炎因子有IL-8、TNF-α等[17]。IL-8、TNF-α可通过促进中性粒细胞及浆细胞的趋化和血管损伤，进而导致结缔组织炎症性损伤；还可通过趋化作用促使中性粒细胞、浆细胞等向炎症部位聚集，促进炎性反应的发生发展[18]。IL-4、IL-10可抑制中性粒细胞的趋化作用，降低促炎因子IL-8等的表达，减轻组织损伤程度，抑制炎症发展[19]。本研究发现，与正常组比较，模型组大鼠上生殖道IL-10、IL-8、TNF-α的蛋白表达水平显著升高，表明炎症反应初期，机体的自我防御机制激活，抗炎因子与促炎因子分泌均增多，促使机体免疫平衡；与模型组比较，各给药组 IL-4、IL-10的蛋白表达水平升高，促炎因子 IL-8、TNF-α表达水平显著降低，提示，参芪扶正汤可显著改善小鼠体内炎症因子水平。

SPID的病程较长、反复发作，单纯的活血化瘀疗法无法从根本上解决问题。在金哲教授自创方“丹枝饮”基础上，添加益气扶正中药，组成参芪扶正汤。其中黄芪、党参、白术等益气扶正中药，效仿清代医家张锡纯《医学衷中参西录》理冲汤，发挥健脾益气、扶正培元的功效，更好地扶正驱邪治疗SPID[20]。黄芪健补中气，党参平补脾气以生气血，白术燥湿益气健脾，三药共为君药，奏“正气存内，邪不可干”之效。现代药理学研究发现，黄芪可以调节巨噬细胞核转录因子，抑制促炎因子的产生，发挥体内和体外免疫调节作用及抗炎作用[21]；白术不仅具有提高细胞免疫功能的作用，还具有抗菌、抗凝血等药物作用[22-23]；党参具有增强机体免疫功能的作用[24]，三者合用可以很好地发挥益气扶正作用。丹参可活血祛瘀止痛，丹参中的丹参酮能扩张外周血管，降低血液黏度，抑制血小板聚集，改善血液循环，且对金黄色葡萄球菌、钩端螺旋体等有明显的抑制作用[25]；当归活血止痛，走而不守，又入血分，有明显抗血栓作用[26]；桑枝可祛风湿、利关节，具有抗炎镇痛及免疫调节作用[27]，三者共为臣药，发挥活血散结消癥的功效，从而改善盆腔血瘀状态。延胡索、鸡血藤、赤芍具有活血行气、通络止痛的功效。研究表明，活血化瘀类中药不仅能够改变血液流变性，改善微循环，还可促进组织修复和再生[28-30]。鸡血藤总黄酮为鸡血藤的主要成分，具有调节免疫、清除自由基、抗氧化等作用[31]。诸药合用，共奏补益正气、养血化瘀、通络止痛之功效。

SPID为一组感染性疾病，是育龄妇女最常见的生殖器官炎性反应[32]。中医药尤其是中药灌肠疗法在治疗SPID中应用广泛，且行之有效[33-34]。因此，本研究设置灌肠组旨在评价灌胃、灌肠以及两者联合的疗效及差异比较。结果显示，药物干预后，小鼠上生殖道组织中抗炎因子IL-4、IL-10的蛋白表达水平显著升高，促炎因子IL-8、TNF-α的蛋白表达水平显著降低，MGS评分显著降低；三个组别之间比较，虽无统计学差异，但灌胃灌肠联合治疗的作用趋势更为显著。

综上所述，参芪扶正汤可通过扶正益气联合祛瘀通络达到抗炎镇痛、提高机体免疫力、改善机体炎症因子水平而治疗SPID的作用。