基于网络药理学的肾炎康复片治疗糖尿病肾病的潜在作用机制研究*

李宝华，陈刚毅

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405）

糖尿病肾病（diabetic nephropahty，DN）是导致慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的主要病因之一[1]。目前西医对DN仍缺乏特异性治疗，治疗手段主要包括一般治疗及控制血糖、血压、血脂等[2]，但具有一定的局限性。中医学认为DN属于“消渴”“虚劳”等范畴。一般认为，本病属本虚标实，治法需兼顾标本[3]。肾炎康复片是名老中医赵恩俭教授的经验方，由西洋参、人参、熟地黄、盐杜仲、山药、白花蛇舌草、黑豆、土茯苓、益母草、丹参、泽泻、白茅根、桔梗等13味中药组成，具有益气养阴、补肾健脾、清解余毒之效。研究表明，肾炎康复片在治疗DN中可有效降低尿蛋白、改善肾功能[4]。现代药理学研究证实，肾炎康复片可改变血液流变学、抑制炎症反应[5]、减少细胞外基质积聚、修复受损足细胞、抑制肾小球系膜细胞增殖[6]等作用。

但目前肾炎康复片对DN的作用机制尚未完全明确。网络药理学是基于系统生物学的理论，通过对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的学科[7]。借助网络药理学的方法分析中成药对疾病的干预和影响，可用于初步筛选中药有效成分、作用靶点及作用机制，减轻后续实验的工作量及风险。本研究拟基于网络药理学，通过数据检索、挖掘和筛选，构建“中药复方-化学成分-靶点-疾病”网络，以阐释肾炎康复片治疗DN的主要化学成分及可能的分子机制，为后续的实验和临床研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 肾炎康复片所含主要化学成分的查询和筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http://tcmspw.com/tcmsp.php），输入肾炎康复片所含的中药名称，即西洋参、人参、熟地黄、杜仲、山药、白花蛇舌草、黑豆、土茯苓、益母草、丹参、泽泻、白茅根、桔梗，检索得到各味中药所含的化学成分。主要化学成分的筛选主要根据机体对药物的吸收、分布、代谢及排泄过程进行评价，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18作为主要化学成分的筛选标准，以判断其对人体的影响和风险[8-9]。另结合中国知网、万方、PubMed等文献数据库对于未从平台中检索出，但具有明确药理作用的活性化学成分也纳入候选主要化学成分，并进行后续研究。

1.2 肾炎康复片主要化学成分潜在作用靶点收集 通过TCMSP平台检索肾炎康复片主要化学成分的潜在靶点，并使用Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/，更新于2018年5月25日）对靶点进行注释，限定物种为“Homo sapiens(Human)”，剔除非人源靶点，获得靶点的标准基因名。使用Cytoscape 3.7.2构建“主要化学成分-作用靶点”的网络图。

1.3 DN疾病靶点的获取 通过GeneCards（https://www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传数据库（online mendelian inheritance in man，OMIM，https://omim.org/）、疾病靶点数据库（therapeutic target database，TTD，http://db.idrblab.net/ttd/）和Drugbank数据库（https://www.drugbank.ca/），检索关键词“Diabete Kidney Disease”“Diabete Nephropathy”“nephropathy，diabetic”以获取与DN相关的靶点，并整理建立DN相关的靶点数据集。

1.4 肾炎康复片作用靶点与DN靶点集的网络构建 将肾炎康复片主要化学成分的潜在作用靶点与DN相关的靶点取交集，并使用R语言VennDiagram version 1.6.20软件绘制韦恩图。将交集的靶点导入注释、可视化和集成发现数据库（the database for annotation,visualization and integrated discovery，DAVID，https://david.ncifcrf.gov/），限定物种为“Homo sapiens”，获得靶基因名的官方名称。使用Cytoscape 3.7.2构建“中药复方-主要化学成分-作用靶点-疾病”的网络图，显示中药复方主要化学成分与DN疾病靶点的关系。

1.5 蛋白质相互作用（PPI）网络构建与关键靶点筛选分析 将肾炎康复片与DN的共有靶点上传至STRING平台（https://string-db.org/），限定物种为“Homo sapiens”，初步建立药物靶蛋白-疾病靶蛋白相互作用网络。设定筛选条件为最低限度的互动分数≥0.900[10]，获得药物靶蛋白-疾病靶蛋白相互作用的信息及网络图。采用Cytoscape 3.7.2软件插件cytoNCA对蛋白相互作用网络进行拓扑分析，分析内容包括度中心性（degree centrality，DC）、中介中心性（betweenness centrality，BC）、紧密中心性（closeness centrality，CC）和特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）等，以筛选出网络中的关键靶点。这些靶点与其他更多靶点拥有相互作用关系，且作用效率更高。设定筛选标准为节点的DC值高于全部节点DC值中位数2倍，且BC、CC、EC值均大于所有节点的中位数，筛选出的节点即为关键靶点[11-12]。将获得的靶点再次通过STRING平台构建PPI网络图，设定筛选条件为最低限度的互动分数≥0.400[13]。并通过Cytoscape 3.7.2软件挖掘关键靶点与其对应的化学成分及中药药物的关系。

1.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 通过Cytoscape 3.7.2软件插件GlueGO v2.5.5对肾炎康复片治疗DN的潜在关键靶点进行基因功能富集分析和通路富集分析。功能富集分析通过基因本体论（gene ontology，GO）数据库进行，分别从分子生物学功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP）和细胞学组分（cellular components，CC）3个功能大类进行富集分析，从而对一个基因的功能进行多方面的描述和分析。通路富集分析通过京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库进行，从而获得基因作用通路的相关信息，研究肾炎康复片治疗DN可能的作用机制。富集分析所获得的P值均使用Bonferroni方法进行校正，以P<0.05为筛选条件，并根据P值从小到大进行排序，选取功能富集分析前20个生物过程及通路富集分析前20条通路，上传至进步源自共享云平台（Omic－Share，https://www.omicshare.com/tools/）进行数据可视化处理。

2 结 果

2.1 肾炎康复片主要化学成分及其潜在靶点的收集和筛选 从TCMSP平台上检索出肾炎康复片13味中药的化学成分，其中西洋参11种、人参22种、熟地黄2种、杜仲28种、山药16种、白花蛇舌草7种、黑豆13种、土茯苓15种、益母草8种、丹参65种、泽泻10种、白茅根33种、桔梗7种，剔除重复成分，并补充文献已报道具有明确药理作用的活性成分后，统计得肾炎康复片化学成分共有211种。根据OB≥30%、DL≥0.18筛选后得出主要化学成分共183种（见表1，由于筛选结果过多，因此仅列出OB值前15项及各味中药中OB值最大项，共20项）。研究较多的如丹参的主要活性成分丹酚酸、丹参酮，以及人参的主要活性成分人参皂苷等亦在此列。将183种主要化学成分输入TCMSP平台，检索出潜在药物潜在靶点共320个。通过Uniprot数据库对靶点进行筛选和注释，剔除非人源靶点后共获得267个药物潜在靶点及其标准基因名。通过Cytoscape 3.7.2获得“中药-化学成分-作用靶点”的网络图，共获得430个节点、3 464条边。从图中可见，不同中药之间可拥有共同的化学成分，而不同化学成分也可对应同一作用靶点，说明肾炎康复片是通过不同中药之间、多种成分及多种靶标之间协同发挥作用。（见图1）

图1 肾炎康复片“中药-化学成分-作用靶点”相互作用网络图

表1 肾炎康复片部分主要化学成分的基本信息

2.2 DN疾病靶点的获取和整理 通过GeneCards、OMIM、TTD和Drugbank数据库获得与DN相关的靶点基因，分别收集到10 661、1 257、20、44个疾病靶点。剔除重复后获得DN相关的靶点基因共11 584个，包括血管紧张肽转换酶（Angiotensinconverting enzyme，ACE）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A9（UDP-glucuronosyltransferase 1-9，UGT1A9）、血管紧张素Ⅱ受体1（Type-1 angiotensinⅡreceptor，AGTR1）等。

2.3 肾炎康复片作用靶点与DN靶点集的网络构建 将肾炎康复片主要化学成分的267个靶点与DN疾病相关的11 584个靶点取交集，得到肾炎康复片作用在DN的潜在靶点258个。通过VennDiagram v1.6.20软件获得韦恩图。（见图2）将258个潜在作用靶点基因导入DAVID数据库获得其官方名称后，通过Cytoscape 3.7.2获得肾炎康复片与DN的“中药复方-主要化学成分-作用靶点-疾病”的网络图，共获得407个节点，1 893条边。（见图3）

图2 肾炎康复片与DN靶点韦恩图

图3 肾炎康复片与DN的“中药复方-化学成分-作用靶点-疾病”关系网络图

2.4 PPI网络构建与关键靶点筛选分析 将肾炎康复片作用在DN的潜在258个靶点上传至STRING平台后得出肾炎康复片靶蛋白-DN疾病靶蛋白相互作用信息及PPI网络图。（见图4A）通过cytoNCA计算网络各节点的DC、BC、CC和EC值，得出网络所有节点的DC值中位数为7，BC值中位数为94.242 287，CC值中位数为0.072 18，EC值中位数为0.025 797 702 5。根据“1.6”的筛选方法，得出43个关键靶点，包括信号转导与转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶3（Mitogen-activated proteinkinase 3，MAPK3）、转录因子AP-1（Transcription factor AP-1，JUN）等。（见表2）通过STRING平台获得43个关键靶点的PPI网络图。（见图4B）通过Cytoscape 3.7.2绘制此43个关键靶点与肾炎康复片的化学成分和中药之间的关系网络图，共获得172个节点，466条边。（见图5）其中可见细胞核受体共激活剂2（Nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、维甲酸X受体α（Retinoic acid receptor RXR-alpha，RXRA）、细胞核受体共激活剂1（Nuclear receptor coactivator 1，NCOA1）等对应的化学成分较多；而丹参、杜仲、人参、山药、黑豆等与这43个关键靶点拥有较多联系。

图4 肾炎康复片-DN潜在靶点（A）和关键靶点（B）PPI网络图

图5 肾炎康复片与DN的“中药-相关化学成分-关键靶点”关系网络图

表2 肾炎康复片治疗DN的关键靶点及其基本信息

2.5 GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析 通过GlueGO v2.5.5对肾炎康复片治疗DN的43个关键靶点进行GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析。通过GO富集分析共获得332个生物过程，其中涉及BP有306个、涉及MF有58个、涉及CC有3个，包括对脂多糖的应答（response to lipopolysaccharide）、RNA聚合酶Ⅱ转录因子的结合（RNA polymeraseⅡ-specific DNA-binding transcription factor binding）、对机械刺激的应答（response to mechanical stimulus）等生物过程。（见图6）通过KEGG富集分析共获得122个通路，主要涉及AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in di－abetic complications）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）等，表明肾炎康复片可通过多个生物过程和多个通路的协调和相互作用以治疗DN。同时从富集分析中可看出这些靶点基因与卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、乙型病毒性肝炎等疾病相关。（见图7）

图6 肾炎康复片治疗DN的43个关键靶点GO生物功能富集分析（前20位）

图7 肾炎康复片治疗DN的43个关键靶点KEGG通路富集分析（前20位）

3 讨 论

DN是糖尿病常见的微血管并发症之一，已成为全球主要的健康问题。目前DN的发病机制尚未完全明确，西医对DN仍缺乏特异性治疗。有研究表明，DN的发病与糖尿病环境导致晚期糖基化终产物的产生并参与循环、生长因子的产生、血流动力学和激素水平的变化有关，进而引起活性氧物质和炎症介质的产生和释放，造成肾脏发生病理变化。内质网应激、自噬、外泌体的活动[14-17]等与DN发病也有关。

中医学认为，随着DN病情发展，其病机及证型有所变化，其中以气阴两虚最为常见，同时兼杂血瘀、湿热、水湿、痰浊等，病位主要在肾、脾[18]，因此治法多以益气养阴、补益脾肾为主，同时注重祛瘀化痰、利水泄浊。肾炎康复片的组方正好体现出这一治则。方中熟地黄益肾补精，养血滋阴，为君药；杜仲补益肝肾，黑豆补肾益阴利湿，人参、西洋参、山药健脾益气养阴，白花蛇舌草、土茯苓清热解毒，共为臣药；丹参、益母草活血化瘀，白茅根清热利水，泽泻利水渗湿，为佐药；桔梗宣肺利气，为使药。诸药合用，补益而不燥腻，清利而不伤损，扶正兼顾袪邪，攻补并举。

研究显示肾炎康复片联合西医常规疗法在DN治疗中优于单纯西医疗法[4,6]。肾炎康复片具有减少血液中IL-6、TNF-α等因子水平，减轻肾脏炎症状态[19]；改善DN环境下的高黏、高凝的血液流变学状态，增加肾组织血液灌注；调节肾脏组织细胞增殖和凋亡[20]等作用，对DN治疗有多通路、多靶点、多功效的特点。但目前其具体的作用成分及靶点尚未明确。

本研究通过网络药理学分析发现，与肾炎康复片13味药相关的化学成分共有211种，筛选后得出183种的主要化学成分，包括薯蓣皂苷元、叶酸、前益母草乙素、多种结构的丹参酮、丹酚酸、人参皂苷等。薯蓣皂苷元来自山药和土茯苓，可改善肾脏炎症状态、减轻氧化应激水平等作用以减轻肾脏纤维化[21]。叶酸来自黑豆，其可通过促进同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）代谢，抑制由于Hcy的增加引起的肾小球内氧化应激和炎症反应及肾脏微循环障碍，对DN起治疗作用[22]。丹参的活性成分丹酚酸，可减轻肾脏组织炎症和增生反应，延缓肾脏纤维化进程；丹参酮可促进葡萄糖的摄取，减轻大鼠肾小管细胞坏死及凋亡，并能抑制氧化应激介导的肾损伤[23]。

通过将肾炎康复片主要化学成分的作用靶点与DN的相关靶点进行匹配，获得258个共同靶点。进一步进行网络拓扑分析及PPI网络构建获得43个关键靶点，说明肾炎康复片中的有效成分可能是通过STAT、MAPK、IL、NFKBIA等药物-疾病共有靶点网络起作用。STAT参与的JAK/STAT通路与MAPK、NF-κB通路皆参与肾脏炎症反应，通过激活IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）等多种炎性因子，引起肾脏内巨噬细胞聚集，触发免疫应答过程，造成肾脏损伤[24-25]。研究表明，肾炎康复片中的薯蓣皂苷元、叶酸等有效成分可通过抑制MAPK和NF-κB通路对肾脏起保护作用[21-22]。而与关键靶点关联较多的中药丹参，其有效成分如丹酚酸、丹参酮等亦可通过抑制MAPK次级的ERK1/2蛋白的表达，抑制肾小球细胞外基质的重构[23]。

对43个关键靶点进行GO生物功能富集分析发现，肾炎康复片治疗DN所涉及的生物过程包括细胞应答（如对脂多糖、活性氧物质的应答）、细胞分裂分化（如白细胞的分裂分化）、蛋白质合成和转运等方面，与临床研究中肾炎康复片减轻DN中肾脏炎症反应和氧化应激水平、修复肾脏损伤细胞等功效相对应。KEGG通路富集分析显示，AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、Toll样受体信号通路等可能是肾炎康复片发挥作用的主要通路。AGE-RAGE通路可通过激活MAPK、NF-κB、JAK/STAT等通路，激活肾脏的氧化应激和炎症反应，引起肾脏损伤[26]。Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）参与机体免疫反应，其中TRL4可通过激活NF-κB通路，介导肾脏炎症反应、氧化应激和细胞破坏[27]。由此推测肾炎康复片可能通过下调高血糖、脂多糖、AGE等介导的上述通路活动对DN起治疗作用。

本研究借助网络药理学，基于多成分、多靶点、多通路理论挖掘并分析肾炎康复片治疗DN的潜在作用机制，为日后关于肾炎康复片治疗DN更深入的基础和临床研究及中药新药研制提供一定的理论依据。但由于数据库信息可能存在不全面、不及时更新等情况，筛选主要化学成分时仅根据其化学结构，忽略了成分的含量、成分间化学反应、成药制备工艺对化学成分的影响等。因此本研究仅为从理论上借助数据库及他人研究成果分析预测探讨肾炎康复片治疗DN的机制，尚需更多的基础实验和临床研究以验证本研究结果的合理性和相关性。