马齿苋对人肝癌皮下瘤裸鼠尿液代谢的影响*

马姝，赵沙沙,2，林玩福,2，汪怀周，程彬彬,2，翟笑枫,2，郑国银,2

（1.海军军医大学第一附属医院，上海 200433；2.海军军医大学中医系，上海 200433）

马齿苋为有名的“救荒本草”，具有清热解毒、凉血消肿之功效，前期我们从马齿苋的有效成分分离出马齿苋总皂苷等物质，并对其作用等进行了系统研究[1-4]，对马齿苋提取物的抗肝癌活性成分进行初步筛选，并观察到马齿苋提取物体外对肝癌细胞的增殖和转移有一定的抑制作用，同时其对裸鼠的体内转移也有抑制作用，能够调节肺转移及血液、肝组织等的物质代谢。有研究报道发现在肝炎-肝硬化-肝癌不同的动物模型中，血浆及肝组织的代谢物质存在明显的变化，其中有二氢鞘氨醇、棕榈酰肉碱、胆汁酸衍生物等代谢标记物[5-6]。在不同的肝癌模型中，马齿苋的体内代谢轮廓和产物又是如何呢？为此我们建立了人肝癌Huh7细胞裸鼠皮下瘤模型，拟从代谢组学水平上，探究马齿苋在肝癌裸鼠皮下瘤模型中的代谢轮廓，本次研究拟动态观察马齿苋在肝癌裸鼠皮下瘤模型不同时间段的尿液的代谢组学轮廓及变化情况，同时探寻贯穿始终的尿液代谢产物。

1 材料

1.1 药物与试剂 马齿苋配方颗粒（江阴天江药业有限公司），其质量标准参考2015年版《中华人民共和国药典》标准，由江阴天江药业有限公司内校质量标准，GZ-SOP0ZE405中药配方颗粒取样操作流程符合质量规定。按照浓缩颗粒:生药为1∶10的比例温水调制成需要的药物浓度，马齿苋高剂量（20 g/mL）、马齿苋低剂量（10 g/mL）。HPLC甲醇（德国Merck公司）；乙腈、甲酸、蒸馏水（德国Merck Dannstadt公司）；2-氯-苯丙氨酸（上海吉尔化有限公司）。

1.2 主要仪器 超净工作台（苏州净化设备仪器厂）；二氧化碳孵箱（德国Heraeus公司）；TSE型电热保温干燥箱（日本SNAYO公司）；脱色摇床（武汉Servicebio）；电子天平（德国Sartorius公司）；全自动组织脱水浸蜡机（日本Tepsarvra公司）；2035型切片机（德国Leica公司）；ZMN-6803型自动温度控制漂片烤片仪（西安华利电子公司）；低温离心机（美国Thermo fisher FRESCO17公司）。

1.3 细胞培养 人肝癌Huh7细胞由上海长海医院中医肿瘤实验室传代保存，用含10% FBS（Fetal Bovine Serum）的高糖完全培养基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM），在37℃、5%CO2完全饱和湿度条件下常规培养，视细胞情况进行传代。

1.4 实验动物BALB/C雄性裸鼠，约4周龄，体质量18～20 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物使用许可证号：SYXK（沪）2015-0017。裸鼠饲养在上海长海医院的SPF级中心实验室动物房，饲料同样购于上海斯莱克实验动物有限公司，垫料及笼具均由中心实验室动物房提供，饲养所有用具均灭菌，用具通过辐照灭菌，饮用水为高压高温灭菌纯净水。实验中的干预药物在辐照灭菌后进入灭菌环境使用。本实验中的裸鼠均自由采食和饮水。本次研究经医学实验动物管理委员会批准。

2 方 法

2.1 裸鼠皮下瘤模型 事先进行细胞复苏培养，待生长平稳后取处于对数生长期、状态良好的Huh7细胞，进行常规消化，离心后去除上清培养基，加入PBS重悬细胞，制成单细胞悬液2×107个/mL，每只裸鼠左下肢内侧皮下注射入200 μL细胞悬液。造模成功后随机分为模型对照组、马齿苋高剂量组、马齿苋低剂量组，每组5只。另取未造模的裸鼠作为正常对照组。接种后第3天开始按照分组进行干预。马齿苋高、低剂量组裸鼠每日每只灌胃200 μL相应浓度的马齿苋溶液，模型对照组、正常对照组裸鼠灌胃200 μL无菌生理盐水。分别于第7、14天通过代谢笼收集各组裸鼠的12 h尿液，3 000 r/min离心10 min，取上清液于-80℃冰箱中冻存待测，马齿苋低剂量组、马齿苋高剂量组、模型对照组、正常对照组样品分别标记为UMD、UMG、UM、UZ。

2.2 样本预处理 本实验采集的尿液样本在收集完后用移液枪吸取100 μL于1.5 mL EP管中。加入300 μL甲醇，并加入5 μL内标（2.8 mg/mL，2-氯苯丙氨酸）。涡旋混匀30 s，-20℃静置1 h。置于4℃离心机中，12 000 r/min离心15 min。吸取200 μL上清，转入进样小瓶中待检测。

2.3 LC/MS分析 采用Thermo Ultimate 3000 LC液相色谱-质谱联用仪，Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流动相为水+0.1%甲酸（A），乙腈+0.1%甲酸（B），流速为0.3 mL/min，柱温为40°C，进样量为4 μL，自动进样器温度为4°C。

2.4 质谱检测参数 本实验过程中分别用正模式（ESI+）、负模式（ESI-）两种模式进行质谱检测。其中正模式具体参数：加热器温度为300℃，鞘气流速为45 arb，辅助气流速为15 arb，尾气流速为1 arb，电喷雾电压为3.0 kV，毛细管温度为350℃，S-Lens RF Level 30%。负模式具体参数：加热器温度为300℃，鞘气流速为45 arb，辅助气流速为15 arb，尾气流速为1 arb，电喷雾电压为3.2 kV，毛细管温度为350℃，S-Lens RF Level 60%。

2.5 数据分析LC/MS检测数据使用Compound Discoverer软件（Thermo公司）进行提取和预处理，其后在Excel 2010中对数据进行归一化及后期编辑，最后整理成二维数据矩阵形式，导入SIMCA-P 13.0（Umetrics AB，Umea，Sweden）软件进行多元统计分析。采用有监督式方法OPLS-DA（正交偏最小二乘法）进行建模分析，组间明显沿t[1]轴分开，提示组间差异明显。模型的参数R2X表示有多少变量作为主要成分构造模型，参数Q2表示模型的预测率、R2Y表示模型的解释率。OPLS-DA得分图中的点距离原点越远其VIP（Variable Importance in the Projection）值越大，代谢产物的差异越明显。对模型的贡献率也越大（阈值＞1）。结合t-test的P值来寻找差异性表达代谢物。筛选差异性表达代谢物标准：VIP值＞1的变量，同时进行t-test检验（P＜0.05）。

3 结 果

3.1 马齿苋对肝癌皮下瘤模型的瘤体抑制情况 正常对照组没有肿瘤，马齿苋高、低剂量组与模型对照组有肿瘤，其肿瘤大小见图1A，马齿苋高、低剂量组的瘤体体积小于模型对照组，并且马齿苋高剂量组的瘤质量明显低于模型对照组（P＜0.05），表明马齿苋能抑制肝癌裸鼠皮下瘤的生长。（见图1）

图1 各组裸鼠瘤体情况比较（±s，n=5）

3.2 第7 天尿液代谢结果分析

3.2.1 PCA分析 对4组尿液进行主成分分析，发现在正模式下共获得5个主成分，累积R2X=0.615，Q2=0.159；负模式下共获得4个主成分，累积R2X=0.568，Q2=0.223。PCA得分图（Scores plot）见图2～3。

图2 第7天4组尿液的PCA得分图（ESI+）

图3 第7天4组尿液的PCA得分图（ESI-）

3.2.2 PLS-DA分析 采用监督性的多维统计方法，也就是最小二乘方判别分析（PLS-DA）对4组样本进行统计分析，以获得导致这种显著差异的代谢物信息。发现在正模式下，其模型质量参数具有2个主成分，R2X=0.28，R2Y=0.429，Q2=-0.018 5；在负模式下其模型质量参数具有2个主成分，R2X=0.283，R2Y=0.422，Q2=-0.21。本次4组数据未出现“过拟合”现象，说明模型能较好的描述样本，并可作为模型生物标记物群寻找的依据。（见图4～5）

图4 第7天4组尿液的PLS-DA得分图及排序验证图（ESI+）

3.2.3 OPLS-DA分析 在有监督式方法OPLS-DA进行建模分析，结果正模式下得到2个主成分和1个正交成分，R2X=0.385，R2Y=0.553，Q2=0.077 3；负模式下得到3个主成分和1个正交成分，R2Y=0.494，R2Y=0.77，Q2=0.119，模型的参数R2Y表示模型的解释率，Q2表示模型的预测率。4组的模型能较好地描述样本，并可作为模型生物标记物群寻找的前提。（见图6～7）

图5 第7天4组尿液的PLS-DA得分图及排序验证图（ESI-）

图6 第7天4组尿液的OPLS-DA得分图（ESI+）

图7 第7天4组尿液的OPLS-DA得分图（ESI-）

3.2.4 第7 天4组尿液差异性代谢产物的挖掘及鉴定VIP（Variable Importance in the Projection）（阈值＞1）是OPLS-DA模型的变量重要性投影值，可以结合t-test的P值（P＜0.05）来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性寻找方法主要通过搜索在线数据库（Metlin）（比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass），差异性代谢物数据见表1，可见在第7天，马齿苋高剂量组、马齿苋低剂量组、模型对照组和正常对照组裸鼠尿液的代谢产物存在差异，其中差异有统计学意义的有17种。

表1 第7天4组尿液差异性代谢产物表

3.3 第14 天尿液代谢结果分析

3.3.1 PCA分析 我们对UZ14组、UM14组、UMG14组及UMD14组进行主成分分析，本分析在正模式下共获得4个主成分，累积R2X=0.669，Q2=0.214；负模式下共获得4个主成分，累积R2X=0.671，Q2=0.341。PCA得分图（Scores plot）见图8～9。

图8 第14天4组尿液的PCA得分图（ESI+）

3.3.2 PLS-DA分析 采用监督性的多维统计方法，也就是最小二乘方判别分析（PLS-DA）对4组样本进行统计分析，以获得导致这种显著差异的代谢物信息。其模型质量参数为：在正模式下，具有2个主成分，R2X=0.297，R2Y=0.489，Q2=0.234；负模式下5个主成分，R2X=0.696，R2Y=0.861，Q2=0.452。正模式下，模型对于解释两组之间差异及寻找差异物质是不可靠的，因此不宜利用此数据进行后续分析；负模式下，模型对于解释两组之间差异及寻找差异物质是可靠的，且从排序验证图来看模型不存在“过拟合”现象，因此可利用此数据进行后续分析。（见图10～11）

图9 第14天4组尿液的PCA得分图（ESI-）

图10 第14天4组尿液的PLS-DA得分图及排序验证图（ESI+）

图11 第14天4组尿液的PLS-DA得分图及排序验证图（ESI-）

3.3.3 OPLS-DA分析 在选用OPLS-DA监督式方法进行进一步建模分析发现，在正模式下得到2个主成分和0个正交成分，R2X=0.291，R2Y=0.494，Q2=0.261；而负模式下得到2个主成分和2个正交成分，R2X=0.636，R2Y=0.611，Q2=0.378，模型的参数R2Y表示模型的解释率，Q2表示模型的预测率。（见图12～13）

图12 第14天4组尿液的OPLS-DA得分图（ESI+）

图13 第14天4组尿液的OPLS-DA得分图（ESI-）

3.3.4 第14 天4组尿液差异性代谢产物的挖掘及鉴定 差异性代谢物数据鉴别方法同前，第14天4组出现的差异有统计学意义的代谢产物鉴定出来的共有43种。（见表2）

表2 第14天4组尿液差异性代谢产物表

3.4 第7 天和第14天共同出现的差异性代谢产物 通过对比第7天和第14天尿液代谢产物的差异发现，经过马齿苋干预后，第14天尿液中代谢产物明显增多，而其中有11种在第7天和第14天均出现，提示这11种代谢产物可能在肝癌裸鼠皮下瘤模型中有特殊的意义。11种代谢产物为吡啶甲酸、顺式粘酸、对羟基苯乙酸、己基甘氨酸、3-磷酸甘油、3-羟基十四烷二酸、吡哆胺、3-羟基吡啶甲酸、酪醇、二氢胸腺嘧啶、黄尿酸。（见表3）

表3 第7天和第14天4组尿液共同的差异性代谢产物

4 讨 论

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，具有预后凶险、病死率高等特点，发现时常为晚期[7-8]，因此针对肝癌早期诊断，以及疗效评价的代谢标志物的研究有深远意义。通过代谢组学研究代谢产物，筛查肝癌潜在的生物标志物，可能为一种较好的肝癌诊断方法。目前已有较多对肝癌相关代谢产物的研究，涉及到的标本有尿液、粪便、组织等。众多学者运用代谢组学探寻肝癌生物学标志物[9]，本课题组长期致力于中医药防治肝癌的研究，先后研究了不同肝癌证候的代谢组学物质的差异，同时对常用中药马齿苋等的抗肿瘤的代谢作用也进行了探索，体内外实验发现马齿苋提取物具有抗炎、抗肿瘤细胞增殖及转移、调节免疫的作用，并可以调节肝癌动物血液氨基酸类、脂肪酸类、有机酸物质相关的体内代谢发挥抑制肝癌转移的作用[11-12]。

此次研究用人肝癌Huh7细胞建立裸鼠皮下瘤模型，在代谢组学水平上，探究马齿苋对该模型尿液代谢组学的影响，以明确马齿苋抗肝癌的作用及其机制。本次实验采用LC/MS仪器对裸鼠尿液样本进行检测，并对尿液样本中这些物质的峰的响应强度数据进行模型判别分析，进行OPLS-DA的模型构建，从而获得差异性表达代谢物。代谢组学结果显示，第7天鉴别出4组之间的代谢产物有17种，第14天4组之间的代谢产物有43种，其中有11种差异物质在第7天和第14天均有，为吡啶甲酸、顺式粘酸、对羟基苯乙酸、己基甘氨酸、3-磷酸甘油、3-羟基十四烷二酸、吡哆胺、3-羟基吡啶甲酸、酪醇、二氢胸腺嘧啶、黄尿酸。在这11种共同代谢产物中，吡啶甲酸、3-磷酸甘油与肿瘤糖酵解过程中糖类代谢有关；顺式粘酸、3-羟基十四烷二酸与机体脂类代谢密切相关；羟基苯乙酸、黄尿酸与肿瘤相关的酪氨酸代谢相关，前者对酪氨酸酶单酚酶具有抑制作用，己基甘氨酸与肿瘤的发生、抗炎和免疫调节密切相关；吡哆胺、黄尿酸为维生素B6代谢通路；二氢胸腺嘧啶则为嘧啶的代谢产物，在肿瘤组织中含量升高。

有氧糖酵解是恶性肿瘤的重要标志。肝癌在导致肝细胞不受限制的无限增殖之后，便开始放缓发展速度，之后在HCC细胞中观察到最常见的代谢现象就是糖酵解速率的增加，这种现象被称为Warburg效应。研究证实糖酵解基因的高表达与肝癌发病风险的升高确有相关，糖酵解酶可能是关于HCC预防的一个潜在靶点，糖酵解与PPP都是异常肝细胞增殖必须的代谢行为。本次研究中从裸鼠的尿液代谢产物中所鉴别出的3-磷酸甘油是糖酵解环节中的关键产物。吡啶甲酸是一种重要的中间体，为异烟酸、烟酸、2-吡啶甲酸的前体，其中烟酸参与了人体组织的氧化还原过程，具有促进细胞新陈代谢的功能，2-吡啶甲酸是一种重要的有机合成中间体，由其制备的吡啶甲酸铬可以调节血糖和胰岛素，在肿瘤中参与糖酵解过程中糖类代谢[10]。

酪氨酸代谢异常在肿瘤发生发展中普遍存在，人们逐渐发现新生血管对肿瘤的增殖和转移至关重要，抗血管生成已经成为肿瘤治疗的重要手段，肝癌是一种血管丰富的实体性恶性肿瘤，研究证实酪氨酸在肝癌患者体内明显升高。研究者对20名健康志愿者和23例HCC患者的血浆进行测定，结果表明，L-酪氨酸明显升高[13]。在本次研究中，观察到在第7天和第14天，裸鼠体内的酪氨酸，以及与酪氨酸代谢相关的代谢产物羟基苯乙酸也存在异常，羟基苯乙酸对酪氨酸酶单酚酶具有抑制作用。顺式粘酸为苯甲酸的儿茶酚邻位裂解（orthocleavage）途径产生，是一种潜在的平台化合物，儿茶酚具有抗肿瘤血管生成的作用。

一项基于LC-MS的大规模代谢组分析技术纳入了1 448例受试者的多中心研究，鉴定和验证了一组新型的肝癌组合代谢标志物：甘氨酸胆酸、苯丙酰色氨酸。大规模临床验证结果显示，该组合标志物能够有效地在高风险的肝硬化人群中发现肝癌患者，其受试者操作特征曲线下面积（AUC）达到0.807～0.930，优于传统的肝癌临床标志物甲胎蛋白（AFP）的0.650～0.725，同时与AFP具有较好的互补性。本次实验中的己基甘氨酸，作为甘氨酸胆酸的前体，在裸鼠的尿液代谢中存在着异常[14]。

氧化应激能够促进肝癌多倍体细胞的出现，有研究发现非酒精性脂肪肝的肝脏细胞的病理性多倍体化，主要由于细胞周期停滞在S/G2期，抗氧化应激能够使细胞重回生理性多倍体状态[15]。既往研究显示维生素B6（吡哆醇）具有很强的抗氧化作用[16]。外源性给予维生素B6可以明显抑制大鼠肝癌细胞、人类和小鼠肿瘤细胞。研究者将33例原发性肝癌患者随机分为安慰剂组（n=16）和维生素B650 mg/d（n=17）组，干预12周后。测定血浆5'-磷酸吡哆醛、同型半胱氨酸、氧化应激指标和抗氧化能力。维生素B6组血浆同型半胱氨酸在第12周显著降低，对于新近接受肿瘤切除术的肝癌患者，补充维生素B6可能通过降低血浆同型半胱氨酸来调节抗氧化能力，而不是具有直接的抗氧化作用。本次研究中，裸鼠尿液中的吡哆胺、黄尿酸为维生素B6代谢通路中主要物质，提示马齿苋可能通过维生素B6代谢途径，来调节抗氧化能力。尿液代谢中的3-羟基十四烷二酸属于长链脂肪酸类有机化合物，由脂肪酸通过欧米伽氧化和不完全β氧化结合而形成的[17]。实验发现，结直肠癌患者血浆中的二氢胸腺嘧啶的含量高于正常人群。因此，血浆中二氢胸腺嘧啶的含量可作为结直肠癌标志物，可用于结直肠癌诊断，判断药物治疗结直肠癌患者是否有效或判断结直肠癌患者的预后情况。嘧啶的代谢产物在肿瘤组织中含量升高。

马齿苋为临床常用药[18]，可以通过影响肝癌体内糖酵解，具有调节酪氨酸、己基甘氨酸等肿瘤相关氨基酸的代谢及抗氧化应激的作用，可调节嘧啶等的尿液代谢来发挥其抑制肝癌的作用，为马齿苋应用于肝癌治疗提供了新的实验依据。

本课题仍有不足之处，鉴于前期马齿苋对肝癌的疗效作用已经明确，且目前没有确切有效的阳性对照药，本课题采用了空白对照和模型对照为研究方法，重点揭示马齿苋在正常和肝癌裸鼠体内的代谢轮廓。由于篇幅所限，马齿苋其他时间点的尿液代谢及血液、肝脏物质的代谢，我们将另行表述。为了提高本次实验中发现尿液代谢中有差异的生物标志物的可行性，后续我们可以通过加大样本量或选用更多的时间节点和不同的标本类别等进行靶向代谢组学的检测研究及其他更深入的探索，为科学揭示马齿苋在肝癌体内代谢的轮廓提供一个多方位的佐证。非靶向代谢组学只是一种检测有效代谢产物的方法，单一组学的数据在揭示生命体生理活动的变化机制方面不够全面，可以根据这些代谢物及其代谢途径归属，并结合已有的基因和蛋白质知识进行多组学整合及多平台整合分析。