米格列醇对慢性心力衰竭大鼠心肌自噬水平的影响

赵丽萍，杨晓峰，朱章琼

（甘肃省酒泉市第二人民医院心血管内科，甘肃酒泉 735000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是因心肌结构或功能受损导致心室泵血、充盈功能下降的一种复杂的临床综合征，属于各类心血管疾病的终末阶段，5 年病死率高达50%，与恶性肿瘤相当［1-2］。因此，深入阐明CHF 的发病机制并建立有效的干预体系已成为当今心血管治疗领域亟需解决的问题。CHF 的发生和发展涉及复杂的心室形态学重构，而细胞结构的更新和代谢活动的改变是该过程的基础［3］。自噬是真核生物中特有的一种高度保守的代谢途径，其通过降解受损细胞结构、衰老细胞器和废弃大分子等实现细胞代谢和更新的需要［4］。研究显示，自噬在心肌肥厚、急性心肌梗死以及CHF 等多种心脏疾病的发生和发展中起着关键的作用［5-6］。米格列醇作为一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，通过可逆性抑制小肠内的α-葡萄糖苷酶，延缓糖分的消化和代谢，从而达到降血糖的效用，已成为2 型糖尿病临床治疗的一线药物［7］。本研究旨在探究米格列醇是否通过相关代谢途径影响CHF 大鼠的心肌自噬水平。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8 周龄无特定病原体型级SD 雄性大鼠75 只购自北京大学医学部实验动物中心（许可证号：SCXK（京）2016-0001），体质量220～260 g。于温度24℃～26℃，湿度50%～65%，昼夜交替12 h 的动物房内适应性喂养一周，期间自由活动与饮食。

1.2 造模与分组

75 只SD 大鼠取15 只作为假手术组，其他大鼠均参考缩窄腹主动脉的方法制备CHF大鼠模型［8］：大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉后，于剑突下腹部正中2～3 cm 处切开皮肤，打开腹腔，分离腹主动脉，平行于腹主动脉放置7 号手术针，用0 号丝线绕手术针结扎，抽离手术针，确认腹主动脉通畅后关腹。假手术组大鼠仅进行腹主动脉分离但不结扎。所有大鼠术后连续3 d腹腔注射20 万U 青霉素以防感染，正常饲养6 周。术后6 周大鼠心脏左心室舒张末压（LVEDP）≥15 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）表明建模成功。建模成功大鼠采用随机数字表法分为模型组、米格列醇低剂量组、中剂量组和高剂量组。低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠每天分别给予2 mg/kg、8 mg/kg 和16 mg/kg 的米格列醇（瑞舒，山东新时代药业有限公司，批准文号：H20083446）灌胃处理，假手术组和模型组大鼠则给予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃处理。各组大鼠连续用药8 周。

1.3 心功能指数测定

各组大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉后，仰卧位固定，采用超声心动图检测治疗后左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimen⁃sion，LVEDD）、左心室收缩末期内径（left ventricu⁃lar end-systolic dimension，LVESD）、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）以及左心室短轴缩短率（left ventricular fraction shortening，LVFS），每组数据取3个连续心动周期的平均值。

1.4 心肌病理学检测

取大鼠心肌组织50 mg 置于10%多聚甲醛溶液中固定后，常规酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋和切片。切片常规脱蜡和水化后，置于苏木精（hematoxylin，H）染色液（北京中杉金桥生物技术有限公司）中染色3～5 min，自来水冲洗1 min。1%盐酸乙醇分化10 s，自来水冲洗1 min，0.2%氨水返蓝30 s，自来水冲洗1 min。伊红（eosin，E）（北京中杉金桥生物技术有限公司）染色2 min，常规脱水、透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察心肌组织病理改变。

1.5 Western blot 检测LC3、p62 表达水平

剪取大鼠心肌组织50 mg，加入1 mL RIPA组织裂解液（碧云天生物技术公司），使用细胞破碎仪充分破碎组织后，冰上静止15 min。4℃14 000g离心10 min，收集上清。加入十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液，沸水浴中煮沸10 min。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入1∶1 000 稀释的LC3（美国Cell Signaling Technology）和p62（美国Cell Signaling Technology）一抗，4 ℃孵育过夜。PBST 洗涤3 次×8 min，加入1∶5 000 稀释的二抗（杭州华安生物技术有限公司），室温孵育2 h，PBST洗涤3次×8 min，ECL（美国Thermo Fisher Scientific 公司）化学发光显色，凝胶成像分析系统分析结果。

1.6 透射电镜检测自噬小体数量

大鼠心肌组织切成＜1 mm3的细胞团块，于2.5%戊二醛磷酸缓冲液中固定过夜。0.1 mol/L 磷酸缓冲液中漂洗3次，每次15 min，1%锇酸固定1 h，双蒸水漂洗3 次，每次15 min。2%醋酸铀（西安鼎天化工有限公司）染色30 min，50%、70%、90%、100%乙醇依次脱水15 min，置于100%丙酮中浸泡2 次，每次15 min。等体积的纯丙酮和EPON812 包埋剂（美国SPI 公司）混合液中室温包埋2 h 后，EPON812 包埋剂继续包埋2 h。37℃烘箱烘24 h，45℃烘箱烘24 h，60℃烘箱烘48 h，切片，醋酸铀染色15 min，双蒸水清洗20 min。柠檬酸铅染色15 min，双蒸水清洗20 min。透射电镜下随机选取5 个视野，统计心肌细胞自噬小体的数量变化。

1.7 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件对数据进行分析，计量资料采用（）表示，组间比较采用t检验；计数资料采用［n（%）］表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能比较

与假手术组相比，模型组大鼠LVEDD 和LVESD 明显升高，LVFS 和LVEF 显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，米格列醇低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠LVEDD 和LVESD 显著下降，LVFS 和LVEF 明显升高，且具有明显的剂量依赖性，差异有统计学意义（P<0.05），提示米格列醇对CHF 大鼠的心功能损伤具有显著的改善作用，见表1。

表1 各组大鼠心功能指标比较 ［n=15，］

表1 各组大鼠心功能指标比较 ［n=15，］

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与低剂量组比较，cP<0.05；与中剂量组比较，dP<0.05

2.2 各组大鼠心肌病理比较

HE 染色结果显示，假手术组大鼠心肌细胞排列整齐，结构完整清晰，无炎性细胞浸润；模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，结构断裂，部分心肌细胞坏死，且有大量的炎性细胞浸润；米格列醇低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠随着米格列醇给药剂量的增加，心肌细胞排列趋向规整，细胞肿胀、坏死以及炎性细胞浸润程度逐渐减轻（图2），并呈明显的剂量依赖性，差异有统计学意义（t=5.027，P=0.008）。

图2 各组大鼠自噬相关蛋白表达比较

2.3 各组大鼠自噬标志蛋白比较

Western blot结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌细胞中LC3-Ⅱ、Beclin1 和Atg5 蛋白相对表达水平明显增加，p62蛋白相对表达水平明显下降（P<0.05）；与模型组比较，米格列醇低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠的LC3-Ⅱ、Beclin1 和Atg5 蛋白相对表达水平显著下调，p62蛋白相对表达水平显著增加，且随着米格列醇剂量的增加，这种变化越明显，差异有统计学意义（t=5.466，P=0.008；t=8.139，P<0.001；t=4.427，P=0.019；t=3.974，P=0.015）。

2.4 各组大鼠心肌细胞自噬小体比较

电镜结果显示，模型组大鼠心肌细胞内自噬小体的数量［（33.26±4.07）个］显著高于假手术组［（7.57±1.14）个］，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，米格列醇低剂量组［（27.51±2.93）个］、中剂量组［（20.84±2.46）个］和高剂量组［（15.03±2.87）个］大鼠心肌细胞内自噬小体的数量均呈剂量依赖性下降，差异有统计学意义（t=7.642，P=0.003），见图3。

图3 各组大鼠自噬小体电镜下图像

3 讨论

米格列醇是德国拜耳公司于20 世纪80 年代开发的一种口服降血糖药物，其结构类似于葡萄糖，通过可逆地竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，延缓葡萄糖及其他单糖在小肠上段的分解和吸收，降低餐后血糖浓度［9］。本研究旨在探究由米格列醇调控的营养丰度的变化是否对CHF 大鼠的心肌损伤具有改善作用及其可能的作用机制。结果显示，模型组大鼠LVEDD 和LVESD 较假手术组明显升高，LVFS 和LVEF 则显著下降，提示CHF模型建立后大鼠心功能受到严重损伤；与模型组比较，米格列醇低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠LVEDD 和LVESD 显著下调，LVFS 和LVEF 则逐渐升高，且呈明显的剂量依赖性，提示米格列醇能有效改善心室舒张和收缩功能，纠正心室血流动力学的异常。此外，病理学结果显示，CHF 模型建立后，模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，细胞形态结构被严重破坏，心肌细胞发生纤维化甚至坏死，并伴有大量炎性细胞的浸润；米格列醇各剂量组则随着米格列醇剂量的增加，心肌细胞排列渐齐，形态结构趋向完整，胶原纤维沉积和炎性细胞浸润逐渐减少。以上结果证明米格列醇对CHF 大鼠的心肌损伤具有较好的保护作用。

自噬是细胞维持自身稳态的一种自适应机制。在生理状态下，细胞内部营养供给充足，自噬维持在较低的水平；在饥饿、缺氧等应激状态下，自噬可通过代谢受损的细胞器和细胞质成分为细胞提供新的营养，起到积极防御作用［10］。但自噬不足或自噬过度，均可影响肿瘤、神经系统疾病、自身免疫性疾病以及心血管疾病等各类疾病的发生和发展［11］。研究显示，自噬在心肌肥厚、心肌缺血、心力衰竭以及心律失常等多种心血管疾病中发挥着保护或损伤的双重作用［12］。Nakai 等［13］的实验显示，将心肌细胞中自噬相关基因Atg5和Atg7敲除后，自噬活性受到抑制，小鼠出现心肌肥厚，心脏收缩功能产生障碍，促进了CHF 的发生；Buss等［14］的研究则表明自噬在改善肥大心肌细胞的功能中发挥着重要作用；Jihyun 等［15］认为生理水平的自噬对心功能的维护具有重要意义，但在压力负荷CHF 模型中的过度自噬也会造成心功能的损伤。

LC3 和p62 在自噬过程中起着重要作用，是目前公认的自噬分子标记物。在自噬过程中，胞浆定位的LC3-Ⅰ经泛素样体系修饰和加工，产生定位到自噬小体的LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ的浓度与自噬发生的程度成正比［16］。p62 也称SQSTM1，在自噬起始时，通过其UBA 结构域与蛋白聚集体形成复合物，并与LC3 在自噬小体的表面结合，将蛋白聚集体导向自噬小体，自噬小体随后与溶酶体融合并降解其内的蛋白聚集体。自噬被抑制将导致p62的大量累积［17］。本研究显示，与对照组比较，模型组大鼠心肌细胞中LC3 的蛋白水平显著上调，LC3-Ⅱ、Beclin1 和Atg5 的蛋白水平明显下降，同时自噬小体的数量显著增加，表明CHF大鼠心肌自噬水平显著上调，这可能是因为CHF 的建立引起心脏收缩功能障碍而无法有效泵血，从而导致缺血缺氧环境的产生，细胞氧化应激的刺激促进了自噬的过度激活，而超生理水平的自噬又可促进心肌细胞的凋亡，加重CHF 的发展。与模型组比较，随着米格列醇剂量的增加，米格列醇各剂量组大鼠的LC3-Ⅱ、Beclin1 和Atg5 蛋白表达逐渐下调，p62 蛋白表达逐渐增加，自噬小体的数量也呈剂量依赖性下调，表明米格列醇可显著抑制CHF大鼠心肌细胞自噬的过度激活。其机制可能是米格列醇通过抑制受损心肌细胞对葡萄糖以及其他成分的分解和吸收，抑制受损心肌组织因外界成分的摄入而导致的氧化应激，从而下调心肌细胞内的过度自噬，最终改善大鼠的心功能损伤。

综上所述，米格列醇可通过抑制心肌细胞的自噬水平改善CHF 大鼠的心功能损伤，但具体作用机制仍有待进一步的研究。