羟丁基壳聚糖携载CD133 抗体温敏膜对内皮祖细胞的影响△

张翠娟，王向真，于帮旭，安 毅，李 丹

（1.青岛大学附属医院重症医学科，山东青岛 266000；2.青岛大学附属医院麻醉医学科，山东青岛 266000；3.青岛大学附属医院心血管内科，山东青岛266000）

目前，经皮冠状动脉支架植入已成为临床救治冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的重要手段，而为了降低支架植入再狭窄率，药物涂层支架应运而生。但近年来，由于现有的药物涂层支架广泛应用于很多复杂病变，甚至出现很多超适应证使用的情况，其再狭窄率再次出现了升高的现象［1-2］。现有的药物涂层支架是通过携载药物缓慢释放，抑制平滑肌的过度增殖，达到降低再狭窄的目的，如临床上常用的雷帕霉素支架，表面携载的雷帕霉素药物，是一种大环内酯类药物，通过阻断细胞周期中的G1 期向S 期的转录，进而阻断细胞的复制，抑制细胞的过度增殖。但其在抑制平滑肌细胞的同时也会抑制内皮细胞的生长，内皮愈合延迟导致支架内血栓的发生风险增高［3］。因此，血管内皮细胞的快速愈合是降低支架内再狭窄及支架内血栓的有效方法。有研究表明，内皮祖细胞可以形成新生血管，分化成心肌样组织，对冠心病患者有良性影响［4］。本课题组率先在国内研究羟丁基壳聚糖携载CD133抗体温敏膜涂层药物支架，即通过内皮祖细胞表面特异性标志物CD133，使携带CD133 抗体的支架捕获含CD133 抗原的内皮祖细胞，并促进其在支架上增殖、分化，使之加速血管内皮的愈合，在降低再狭窄率及支架内血栓方面更具优势［5-6］。而且壳聚糖能够促进血管内皮细胞的增殖和迁移，且具有良好的血液相容性和抗动脉粥样硬化作用［7］。本文主要通过显微镜观察、定量实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）等方法，探究羟丁基壳聚糖携载CD133抗体温敏膜相比于临床常用的钴铬合金片、雷帕霉素涂层钴铬合金片，对内皮祖细胞黏附、迁移能力，及促进内皮祖细胞向内皮细胞分化的作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载CD133+抗体温敏膜由中国海洋大学制备；3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物序列、内皮型一氧化氮合成酶（endo⁃thelial nitric oxide synthase，eNOS）引物由上海生工公司合成；钴铬合金片、雷帕霉素涂层钴铬合金片由上海微创公司制备；EGM-2 MV SingleQuots培养基购自美国LONZA 公司；Dil 标记的乙酰化低密度脂蛋白（acetylated low density lipoprotein，ac-LDL）、FITC 标记的荆豆凝集素I（FITC-UEA-I）均购自美国Sigma 公司；FITC 标记的CD133 单克隆抗体、PE 标记的CD34 单克隆抗体、PE 标记的KDR 单克隆抗体均购自美国BioLegend 公司；TRI⁃zon 总RNA 提取剂、cDNA 第一链合成试剂盒、SYBR Green I 试剂盒、PCR 专用八连排管、定量RT-PCR 仪均购自瑞士Roche 公司；细胞培养板、激光共聚焦显微镜专用培养皿购自美国Corning公司；紫外分光光度计购自美国Thermo Fisher 公司；二氧化碳细胞培养箱购自日本SANYO 公司；CKX41 型倒置相差显微镜购自日本OLYMPUS公司；多波长激光共聚焦显微镜购自德国LEICA公司。

1.2 方 法

1.2.1 人外周血淋巴细胞分离、培养 取健康成人外周血10 mL，经人外周血淋巴细胞分离液离心，分为血浆层、淋巴细胞层、分离液层、红细胞层，小心吸取淋巴细胞层，磷酸盐缓冲液（phos⁃phate buffered saline，PBS）清洗3 遍后获得人外周血淋巴细胞，将获得的细胞移入载玻片中，并浸没于EGM-2 液体培养基中培养。

1.2.2 贴壁细胞双荧光染色鉴定 取培养7 d的贴壁细胞，用PBS 洗涤后，贴壁细胞加入2.4 μg/mL Dil-ac-LDL 12 μg，置培养箱中孵育4 h 后，经PBS洗涤、甲醛固定后再加入10 μg/mL FITC-UEA-I 10 μL，孵育1 h，PBS 洗涤后用90%的甘油封片，在荧光共聚焦显微镜下观察细胞染色情况。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞表型 7 d 后用经PBS洗涤，贴壁细胞以0.25%胰蛋白酶2 mL 消化5 min，加入10%胎牛血清2 mL 终止消化，PBS 反复冲洗培养孔，收集消化下来的细胞进行离心，弃掉上清液，加PBS 稀释计数，调整细胞浓度为2 × 105/mL。与标记的CD34、CD133、KDR 单克隆抗体在4℃孵育30 min，PBS 重复洗涤并重悬细胞，用细胞流式仪检测结果。

1.2.4 内皮祖细胞分组、培养 取内皮祖细胞重悬于EGM-2 培养基中，以2×105/mL 的浓度接种到铺有3 种钴铬合金片膜的6 孔培养板中培养，分别记为裸钴铬合金片组（裸金属组），雷帕霉素药物涂层钴铬合金片组（雷帕霉素组），复合羟丁基壳聚糖携载CD133 抗体温敏膜钴铬合金片组（抗体温敏膜组）。

1.2.5 黏附及迁移能力测定 内皮祖细胞培养7 d后经胰蛋白酶消化，PBS 反复洗涤3 次后，调整细胞浓度为1×105/mL。（1）黏附能力测定：取1 mL 接种在包被有人纤维连接蛋白的培养板中，在培养箱中培养30 min。再次经PBS 洗涤后在显微镜下观察，随机取3 个视野（×200）计数贴壁细胞，结果取平均值。（2）迁移能力测定：取200 μL 细胞悬液加入transwell小室的上室，600 μL培养液加入下室，孵育24 h。取出transwell 小室，用PBS 洗涤，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，下层的细胞用4%多聚甲醛固定10 min。细胞用Giemsa 染色后，在显微镜下观察，随机选取3 个视野（×200），计数迁移细胞，结果取平均值。

1.2.6 实时定量RT-PCR 收集细胞后，加入TRIzol混匀裂解细胞，经氯仿抽提，异丙醇沉淀，提取细胞样本中总RNA，用紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度。用cDNA 试剂盒进行反转录，将RNA 模板、引物（eNOS 引物序列：For 5′-GTT TGT CTG GGG CCA TGT TA-3′ Rev 5′-GGG TGC GTA TGC GCC TTC TC-3′）、5×RT mix 和RNA 酶溶液溶解并置于冰上备用。先以RNA 为模板，在PCR 仪上37℃进行反转录反应15 min，85℃下5 s 使反转录酶失活，得到反转录的cDNA。向反应管中加入反应体系，将反转录的cDNA 为模板，用GAPDH 为内参引物（引物序列：For 5′-CTG CAC CAC CAA CTG CTT AG-3′ Rev 5′-AGG CCA TGT GGG CCA TGAGG-3′），并设定PCR 仪反应程序，预变性一个循环，反应温度为95℃15 min，扩增循环的次数为45 次，扩增循环的温度为95℃10 s，退火温度为60℃10 s，延伸温度为72℃20 s，溶解曲线为一个循环数，温度为95℃5 s，新增设置温度65℃1 min。然后用凝胶电泳检测反转录是否成功。采用2-△△Ct法进行数据的相对定量分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件对数据进行分析。计量资料以（）表示，组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内皮祖细胞的荧光鉴定结果

显示红色荧光的为ac-LDL阳性细胞（图1-1），显示绿色荧光的为UEA-1 阳性细胞（图1-2），显示双荧光阳性（黄色）的细胞被认为是内皮祖细胞（图1-3）。

图1 激光共聚焦显微镜示贴壁细胞吞噬Dil-ac-LDL 及FITC-UEA-I 的荧光显色图像（×200）

2.2 内皮祖细胞的流式细胞仪检测结果

培养7 d的细胞CD133表达率为（20.65±2.70）%，CD34表达率为（33.90±3.31）%，KDR表达率为（62.98±3.18）%（见图2）。

图2 培养7 d 贴壁细胞CD133、CD34、KDR 的表达率

2.3 3 组内皮祖细胞的生长情况比较

新分离的细胞呈透亮圆形，接种后不久开始贴壁，3 d 后出现集落，7 d 后细胞增大，接种于3 种金属板上的内皮祖细胞继续生长，接种7 d 的内皮祖细胞呈卵圆形（图3-1、2、3），14 d 后分化良好，大部分呈长梭形，小部分呈圆形（图3-4、5、6），其中抗体温敏膜祖细胞数量多于其他两组。

图3 内皮祖细胞光学显微镜下图像（1-3 依次为接种7 d 的裸金属组、雷帕霉素组、抗体温敏膜祖内皮组细胞；4-6 依次为接种14 d 裸金属组、雷帕霉素组、抗体温敏膜组内皮祖细胞；×200）

2.4 内皮祖细胞数量及黏附、迁移能力

抗体温敏膜组接种7 d 的细胞个数较其余两组高（P<0.01），根据黏附能力测定实验、transwell小室法，抗体温敏膜组细胞黏附个数较裸金属组与雷帕霉素组高（P均<0.01），细胞迁移个数也较其余两组高（P均<0.01），抗体温敏膜组细胞的黏附能力及迁移能力较其余两组增高，详见表1。

表1 3 组内皮祖细胞黏附、迁移能力比较 ［］

表1 3 组内皮祖细胞黏附、迁移能力比较 ［］

注：与裸金属组比较，**P<0.01；与雷帕霉素组比较，1）**P<0.01

2.5 内皮祖细胞中内皮型一氧化氮合成酶基因的水平

定性定量检测细胞表达的eNOS 基因的水平，PCR 仪示3 组内皮祖细胞的Ct 值及内参校正后的△Ct。抗体温敏膜组内皮祖细胞△Ct 值较裸金属组与雷帕霉素组的△Ct 值低（P均<0.01），根据2-△△Ct公式［△△Ct=（目的基因Ct 值—内参基因Ct值）实验组—（目的基因Ct 值—内参基因Ct 值）对照组］计算可得出相对表达量，抗体温敏膜组eNOS 基因含量是裸金属组基因含量的2.43 倍，是雷帕霉素组基因含量的5.90 倍，详见表2。

表2 3 组内皮祖细胞目的基因Ct 值及内参校正△Ct 值比较 ［］

表2 3 组内皮祖细胞目的基因Ct 值及内参校正△Ct 值比较 ［］

注：与裸金属组比较，**P<0.01；与雷帕霉素组比较，1）**P<0.01

3 讨论

自1977 年德国的学者Gruentzig 成功完成世界第一例经皮冠状动脉球囊成形术后，冠心病血运重建理念和治疗方式发生了革命性的变化，至今，经皮冠状动脉介入（percutaneous coronary inter⁃vention，PCI）治疗已发展成为治疗冠心病的常规方法。裸金属支架时期的支架内再狭窄率为20%～30%，药物涂层支架的应用使支架内再狭窄率降至10%以下［8］。但近年来，伴随着更多的复杂病变应用药物涂层支架，使支架内再狭窄发生率增加到10%以上［9］，这是目前支架面临的亟待解决的问题。

迄今为止，人们认为药物涂层支架内发生再狭窄或血栓形成的机制如下。（1）血管再内皮化延迟：支架在植入过程中，极易损伤血管内皮，损伤的内皮细胞使血小板黏附、聚集，形成血栓，而药物涂层支架携载的药物，如雷帕霉素，在抑制平滑肌细胞增殖的同时也抑制血管内皮细胞的内皮化，使损伤部位难以愈合；（2）炎症因子作用：支架置入初期，损伤的血管内皮部位会聚集大量的单核细胞及T 细胞。各种炎性因子会促使白细胞趋化到损伤部位，导致炎性反应。炎性反应会增加血管壁的通透性，导致水肿，进一步降低血管的横截面积，血栓形成及细胞的聚集都会加重管腔狭窄。由此可见，内皮受损是支架内再狭窄发生的始动因素［10］，尤其在支架植入晚期，可以增加支架内血栓形成的风险。目前，临床上通过延长阿司匹林联合氯吡格雷或替格瑞洛双联抗血小板的时间来预防晚期血栓的发生，但明显增加了出血风险。因此，如何加速血管内皮的修复，降低再狭窄率，促使内皮祖细胞捕获支架的研究成为目前心血管病领域的研究热点之一。本研究立足于该热点，以内皮祖细胞为突破口，探究羟丁基壳聚糖CD133+抗体温敏膜对内皮祖细胞的黏附、迁移能力。

目前，通常采用流式检测CD34、CD133、KDR联合荧光鉴定的方式来鉴定内皮祖细胞，本研究发现显示红色荧光的为ac-LDL 阳性细胞，显示绿色荧光的为UEA-1 阳性细胞，显示双荧光阳性（黄色）的细胞是内皮祖细胞，且内皮祖细胞中CD34、CD133、KDR 均有表达，但CD133 抗原是5 次跨膜的糖蛋白，特异性是最强的，高度保守，只在骨髓及外周血造血干细胞和内皮祖细胞中表达［11］。因此，CD133 为比较优势的抗体选择，通过包被于支架表面，捕获外周循环血中含CD133 抗原的内皮祖细胞，使其贴服于支架表面，促进其分化为内皮细胞，加速再内皮化的步伐，降低主要不良心血管事件的发生风险。

支架涂层在整个支架中起到重要作用，良好的支架涂层必须具备以下特点：无毒性、良好的血液相容性、无凝血活性［12］。现有支架多采用聚乳酸等聚合物，长期刺激血管，易造成支架周围炎症，在各种炎症因子的刺激下，血管易发生完全晚期血栓，造成支架内再狭窄［13］。因此，开辟良好血液相容性的支架涂层也是对降低再狭窄极为有利的方式。壳聚糖化学名称为β-（1，4）-2 脱氧-D-葡萄糖，其分子上携带一个碱性的胺基，因此不溶于中性和碱性环境，可溶于酸，具有良好的生物学相容性、血液相容性、无毒性、促进伤口愈合、抗感染等特点，在医疗卫生界得到广泛应用。而羟丁基壳聚糖是在壳聚糖的基础上对其进行化学改进，对比壳聚糖，其有溶于水的理化特性，并且抑菌能力也大大增强。羟丁基壳聚糖是一种可逆的水溶胶，有温度和pH 敏感性［14］。其表面带正电荷，可以自动吸附带负电的蛋白，便于细胞定植在涂层表面进行攀爬、增殖，其分子所含的氨基葡萄糖可以与细胞表面的受体相互作用，促进细胞生长，在4个以上的氨基葡萄糖上表现尤其明显。

本研究通过羟丁基壳聚糖携载CD133 抗体温敏膜与裸金属组及雷帕霉素组相比，发现羟丁基壳聚糖携载CD133 抗体温敏膜能够更好的促进人外周血内皮祖细胞的的生长、迁移和黏附，具有良好的生物相容性和血液相容性，其eNOS 表达水平的增高，表示能促进外周血内皮祖细胞向内皮细胞的转换，因此，羟丁基壳聚糖携载CD133 抗体可以加速支架表面的内皮化，降低血管的再狭窄率，有安全性及一定的经济效益，可作为一项新型支架材料服务于介入治疗，造福于人类。