热应激联合HBsAg刺激增强人树突状细胞免疫学特性

黄新亮，余方流，王凤各，董博翰

(皖南医学院基础医学院，安徽 芜湖 241002)

据世界卫生组织报道，全球约有2.57亿乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)慢性感染者，每年约有88.7万人死于HBV感染相关疾病。中国一般人群慢性HBV感染者约7 000万例，对中国社会造成沉重的经济负担[1]。研究者发现慢性乙型肝炎患者树突状细胞(dendritic cell，DC)的功能低下可导致患者体内T、B细胞的耐受状态[2]。如何制备DC疫苗、增强其免疫活性及抗HBV的细胞毒效应成为难题。

DC疫苗的安全性方面，德国美因茨大学(Mainz University)Jonuleit H等[3]发现TNF-a、IL-1b和IL-6 3种CK(细胞因子)组合后，在无牛血清培养体系中能够将未成熟DC诱导成完全成熟的DC，避免了动物血清培养DC对人产生的毒副作用。DC疫苗的有效性方面，Tomoko Ichiyanagi发现经42℃热应激后DC中的内源性热休克蛋白即HSP90对OVA抗原在抗原交叉呈递过程中也起着至关重要的作用[4]；也有研究者在Nature期刊发文指出外来的HSP亦能促进DC成熟[5]。

本研究基于DC的安全应用技术和热休克蛋白增强疫苗有效性的理论，进一步探讨热应激和HBsAg刺激的树突状细胞的免疫特性(成熟度、HSP90的表达及功能、激活CTL的能力)及其诱导的特异性CTL的细胞毒效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 对象 选择健康志愿者，纳入标准：年龄均为20岁，经健康体检HBV为阴性且无乙型肝炎发病史。

1.1.2 主要试剂 静脉血中分离的人淋巴细胞。HBsAg、无血清AIM-V培液、HepG2.2.15(转染HBV的DNA)、荧光素标记抗人CD3单克隆抗体和抗人CD8单克隆抗体、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-1b、IL-6和GM-CSF(Biolegend公司)；HSP90的ELISA 试剂盒(上海森雄科技有限公司进口分装)。

1.2 方法

1.2.1 制备DC疫苗 实验细胞分4组，每组7例。热应激联合HBsAg组：即HBsAg联合42℃加热刺激DC。利用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，将分离的PBMC置于4孔板中，在37℃、含5% CO2的培养箱中培养2 h； 4孔板中贴壁的为DC(收集未贴壁的细胞并且冻存，以便后期和DC共培养)。向4孔板中加入3毫升/孔无血清AIM-V培液和100 ng/ml GM-CSF、100 ng/ml IL-4。第4天DC中加入HBsAg(10 ng/ml)并经过42℃培养30 min。加入CK后显微镜观察细胞形态的变化，CK按照文献常规加入：TNF-a 10 ng/ml、IL-1b 10 ng/ml、IL-6 1000 U/ml，收集第8天实验组和对照组的DC准备鉴定[3]。热应激组：DC经过 42℃培养30 min，不负载HBsAg，其余和热应激联合HBsAg组相同。HBsAg组：DC负载HBsAg，不用42℃温度处理，其余和热应激联合HBsAg组相同。对照组：DC不负载HBsAg、也不经42℃温度处理，其余和热应激联合HBsAg组相同。

1.2.2 流式细胞仪鉴定 DC培养过程中，倒置显微镜观察细胞形态学变化；采用流式细胞仪检测各组DC表面标志分子CD80、CD40及HLA-DR的变化。

1.2.3 ELISA法检测HSP90 按照热休克蛋白90(HSP-90)ELISA检测试剂盒说明书检测，于波长450 nm的酶标仪上读取各孔的A值，以吸光度A值为纵坐标(Y)，相应的HSP-90标准品浓度为横坐标(X)，做得相应的曲线，样品的HSP-90含量可根据其A值由标准曲线换算出相应的浓度。

1.2.4 DC刺激自身淋巴细胞反应与鉴定的方法 各组DC疫苗刺激自身淋巴细胞：收集第8天实验组和对照组的DC，计数以1×106个/毫升作为刺激细胞，加入到4孔板中(实验组和对照组DC数相同)。复苏冻存的初始T细胞，计数，按T细胞：DC=20∶1的比例往DC中加入初始T淋巴细胞。加入500 IU/ml IL-2，置于37℃、含5% CO2的培养箱中培养，4 d后收集活化的T细胞。台盼蓝染色后显微镜观察细胞形态和活性。检测CD8+T细胞：每孔100 μl PBMC细胞悬液中加入5 μl PE标记的抗人CD3克隆抗体、5 μl FITC标记抗人CD8单克隆抗体，4℃避光染色30 min，用3%FBS-PBS洗细胞1次，悬浮于500 μl 3%FBS-PBS中，4℃避光保存，荧光抗体染色后，用流式细胞仪C6检测，获取细胞数不少于100 000个。

1.2.5 LDH法检测DC诱导的特异性 CTL细胞毒效应检测细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)杀伤活性以乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)法，靶细胞为HepG2.2.15(转染HBV的DNA)，效靶比为1∶25。CTL杀伤活性=(效靶混合细胞释放A值-自然释放A值)/(最大释放A值-自然释放A值)。

2 结果

2.1 各组DC中表达CD80、CD40、HLA-DR的比率比较 热应激联合HBsAg组(heat stress combined with HBsAg组)DC中表达CD80、CD40、HLA-DR分子的比率显著高于热应激组(heat stress组)、HBsAg组和对照组(P<0.05)，见图1。

注：A为CD80表达；B为CD40表达；C为HLA-DR表达；与control组比较，*P<0.05；与heat stress组比较，#P<0.05；与HBsAg组比较，△P<0.05。

2.2 各组DC中表达HSP90水平比较 热应激联合HBsAg组DC中表达HSP90水平显著高于热应激组、HBsAg组和对照组(P<0.05)，见图2。

注：与control组比较，*P<0.05；与heat stress组比较，#P<0.05；与HBsAg组比较，△P<0.05。

2.3 各组DC中HSP90水平与表达CD80、CD40及HLA-DR的比率的线性相关分析 热应激联合HBsAg组HSP90水平与DC中表达CD80、CD40及HLA-DR的比率呈现正相关(见图3)，相关系数r分别是0.73、0.69、0.78；热应激组、HBsAg组、对照组HSP90水平与该组DC中表达CD80、CD40及HLA-DR的比率呈现无相关(相关系数=0)。

图3 热应激联合HBsAg组HSP90与CD80、CD40、HLA-DR的比率的线性相关分析

2.4 各组DC刺激自身淋巴细胞增殖的比率 热应激联合HBsAg组DC刺激自身淋巴细胞增殖，T细胞中CD3+CD8+T的比率显著高于热应激组、HBsAg组和对照组(P<0.05)，见图4。

注：与control组比较，*P<0.05；与heat stress组比较，#P<0.05；与HBsAg组比较，△P<0.05。

2.5 各组DC诱导的特异性CTL细胞毒效应 热应激联合HBsAg组CTL杀伤活性的百分率明显高于热应激组、HBsAg组和对照组(P<0.05)，见表1。

表1 各组DC诱导的CTL对靶细胞的细胞毒效应

3 讨论

本研究为探索DC免疫活性的增强提供了新思路。Ichiyanagi T等[4]发现经42℃热应激后DC中的内源性HSP90对OVA抗原在抗原交叉呈递过程起着至关重要的作用；也有研究者发现DC之外的外源性HSP与CD91受体结合进入树突状细胞，亦能促进DC成熟[5]。HSP70/HBxAg复合物促进DC的成熟、HSP通过MHCI和Ⅱ类分子将肿瘤相关抗原呈递给抗肿瘤CD8+T和CD4+T细胞并使之活化，这将会促进针对癌症和传染病的新一代预防和治疗候选DC疫苗的产生[6-8]。而本研究发现热应激联合HBsAg刺激的DC比HBsAg和热应激分别刺激的DC抗原提呈活性更强，且能诱导自身淋巴细胞增殖、产生更多特异性CTL。这些发现为探索DC免疫活性的增强提供了新途径。

本研究为提高CTL抗HBV的细胞毒效应提供新佐证。已有研究表明，慢性HBV感染者发生免疫耐受的重要原因是HBsAg特异性细胞毒性T细胞数量缺乏和(或)功能不足[9]。因而选择合适的易受HBV感染的人群进行免疫治疗，才能体现治疗性疫苗的功效[10]。本研究发现热应激联合HBsAg刺激的DC诱导的特异性CTL具有更强的细胞毒效应，这一发现为探究抗HBV的细胞毒效应提供新佐证。

本研究亦为开发治疗慢性乙肝的安全、有效的DC疫苗提供新的实验依据。一方面，本研究从临床前期研究出发，以人外周血单个核细胞制备DC，在无动物血清培养体系中将未成熟DC诱导成完全成熟的DC；从而避免疫苗中动物血清成分对人体的毒副作用。另一方面，世界卫生组织提出了2030年消除病毒性肝炎的目标[11-12]，这给有效治疗慢性乙型肝炎带来挑战。而本研究发现热应激联合HBsAg刺激的树突状细胞具有良好的抗原提呈能力，其能诱导更明显的特异性CTL细胞毒效应。这为临床研发有效地治疗慢性肝炎的DC疫苗提供依据，有望成为治疗慢性肝炎的新的候选疫苗。从本研究的结果可知，与热应激、HBsAg分别刺激DC比较，热应激联合HBsAg刺激的DC成熟度、HSP90的表达水平及激活CTL的能力均提升，且能诱导更明显的特异性CTL细胞毒效应。但HSP90以何种信号转导机制促进DC的免疫活性，有待深入研究。另外受条件限制，未进行研究对象的性别和不同年龄段的分类研究，因而研究结果有一定的局限性。