非小细胞肺癌组织DSG3与Ki-67表达相关性及预后意义

赵甜甜 滕圣敏 满其荣 王祥阁 张新东

1济宁医学院附属滕州市中心人民医院病理科，山东 277500；2济宁医学院附属滕州市中心人民医院肿瘤科，山东 277500

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌总数的75%～80%，是肺癌最主要的病理类型，其5年总生存率低于15%，肺癌患者生存率低的原因包括肺癌确诊较晚，并且有些难以有明确的病理诊断导致错过最佳治疗时机，肿瘤出现转移，缺少明确判断预后和监测治疗反应的标志物等［1］。Ki-67 表达于增殖细胞中，是与肿瘤细胞增殖相关的核蛋白，可用于判断肿瘤的增殖性和侵袭性［2］。细胞桥粒芯蛋白（desmoglein，DSG）3 是构成复层上皮桥粒的重要跨膜蛋白，桥粒是上皮细胞间的细胞连接结构，如果上皮细胞中的DSG3 表达异常，将会影响桥粒连接的形成，根据其自身的结构和功能特点，DSG3在肿瘤细胞中的异常表达必然与肿瘤转移和患者预后相关。临床上DSG3 在肿瘤中应用较多的是作为鳞癌标志物应用于鉴别诊断鳞癌与其他类型肿瘤，最新研究显示DSG3 在一些上皮性肿瘤如食管癌、直肠癌或头颈部肿瘤等有异常表达，并且其表达量的减少或增多与肿瘤的致癌或抑癌过程明显相关［3-4］。本研究使用免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）方法检测DSG3 在肺鳞状细胞癌和肺腺癌等NSCLC 组织中的表达，分析其与肿瘤增殖标志物Ki-67 及与预后相关的临床病理指标的相关性，探讨DSG3的表达状态对NSCLC患者预后的影响。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 收集滕州市中心人民医院在2015 年7 月至2019 年12 月期间经外科手术切除的NSCLC标本72 例，包括肺鳞状细胞癌30 例，肺腺癌42 例。其中男51 例，女 21 例。年龄范围 46～80 岁，中位年龄 65 岁。所有标本经术后常规组织病理确诊为肺鳞状细胞癌或肺腺癌。本研究使用NSCLC患者手术切除的石蜡组织标本做相关检测，所有检测符合滕州市中心人民医院医学伦理委员会的相关要求。

1.1.2 实验仪器和试剂 全自动免疫组织化学染色机（型号Leica BOND-MAX）购自德国徕卡公司；一抗DSG3（鼠抗人单克隆抗体，克隆号：5G11）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Ki-67（鼠抗人单克隆抗体，克隆号：MIB-1）购自福州迈新生物技术公司；二抗免疫显色试剂购自上海徕卡生物系统公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测方法和结果判读 所有标本使用10%中性甲醛缓冲液固定12～24 h，经全自动脱水机固定、脱水、透明后，石蜡包埋，做连续切片，切片厚度为4～5µm，裱贴于黏附载玻片（已经APES 处理）上，于65 ℃烤片30 min，全自动免疫组织化学染色机染色，染色程序结束后，脱水透明，中性树胶封片。更换不同批次的抗体时均设阳性对照和阴性对照。免疫组化结果判读由两位高年资主治医师共同阅片。DSG3阳性表达结果为细胞膜有棕褐色颗粒沉着，当阳性细胞数多于肿瘤细胞总数的10%或灶性区域出现强阳性表达时即可定义为DSG3 表达阳性；Ki-67 阳性表达结果为位于细胞核的棕褐色颗粒，表达值是阳性细胞数占肿瘤细胞总数的比值，需至少计数500个肿瘤细胞。

1.2.2 随访 采用电话、门诊和住院的方式随访患者的总生存期。随访截止时间是2019 年12 月。随访时间13～52 个月，中位随访时间是28 个月。总生存期是从确诊肿瘤开始，至因任何原因引起死亡或随访截止日期的时间。

1.2.3 统计学方法 使用Graph pad6.0 软件对所有数据做统计学检验并作图。各计量资料均符合正态分布。各组 Ki-67 表达值以（）表示，组间比较采用独立样本t检验；使用χ2检验计算分析DSG3 表达相关影响因素；使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并通过Log-rank检验比较两组生存曲线之间的差异。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NSCLC 组织DSG3 和Ki-67 的表达水平 使用免疫组化方法检测72 例NSCLC 标本中DSG3 和Ki-67 的表达，包括肺鳞状细胞癌30 例，肺腺癌42 例。结果显示DSG3 表达阳性29 例，阴性 43 例，阳性表达率40.28%；肺鳞状细胞癌组与肺腺癌组Ki-67表达分别为（35.00±14.02）%、（28.81±13.83）%，两组比较差异无统计学意义（P=0.067）；DSG3 阳性组与 DSG3 阴性组 Ki-67 表达分别为（27.07±12.21）%、（34.30±14.74）%，两组比较差异有统计学意义（P=0.032），DSG3 阳性组的 Ki-67 表达值明显低于 DSG3 阴性组。

2.2 NSCLC 组织DSG3表达相关影响因素分析 72例NSCLC 标本中，DSG3 表达阳性29 例，阳性表达率40.28%。DSG3表达状态与肿瘤的病理类型明显相关，肺鳞状细胞癌组DSG3 阳性表达率明显高于肺腺癌组（P＜0.001）；DSG3 表达阳性与肿瘤分化程度相关（P=0.033），肿瘤分化越差，DSG3 阳性表达率越低；DSG3 表达阳性与淋巴结是否出现转移相关（P=0.016），淋巴结转移组的DSG3 阳性表达率明显低于无转移组；DSG3表达状态与其余临床病理特征均无明显相关性（均P＞0.05）。见表1。

表1 NSCLC组织中DSG3表达相关影响因素分析

2.3 DSG3 表达与NSCLC 患者预后的关系 使用Kaplan-Meier法对72例NSCLC患者进行生存分析，DSG3表达阳性组患者中位生存时间26 个月，DSG3 表达阴性组患者中位生存时间30 个月；患者的总生存期在DSG3 阳性表达组与DSG3阴性表达组无明显差异（P=0.204）。见图1。

图1 NSCLC患者DSG3阳性组（29例）与DSG3阴性组（43例）的生存曲线

3 讨 论

目前发现 DSG 有 4 种亚型，为 DSG1、DSG2、DSG3、DSG4，它与桥粒胶蛋白（desmocollin，DSC）组成钙黏素超家族，并与桥粒斑蛋白（desmoplakin，DP）共同组成细胞黏附结构桥粒或半桥粒［5］，桥粒连接通过影响细胞之间的信号传导参与调节上皮细胞的形成、增殖和分化过程。一些临床研究和体外实验已经明确证实DSG3 的表达水平与肿瘤的临床分期和转移有关［6-7］。DSG3 也是鳞状上皮细胞比较敏感、特异的标志物，有文献报道，DSG3在肺鳞状细胞癌组织中有大量表达［8］。之前的研究发现，在NSCLC 组织中，应用免疫组织化学方法检测DSG3 的表达可有效区分肺鳞状细胞癌和肺腺癌，尤其是在低分化肺癌标本，可提高肺癌诊断准确率，更好地指导临床治疗［9］。

Ki-67是存在于细胞核基质的增殖抗原，它表达于细胞分裂周期除静止期（G0 期）以外的各个时期，一旦增生期结束，细胞内表达的Ki-67就会迅速降解。所以Ki-67表达水平的高低反映肿瘤细胞的增殖速度，常被临床应用为评估肺癌预后的指标［10］。本研究统计结果显示，Ki-67表达在肺鳞状细胞癌组与肺腺癌组中差异无统计学意义。既往有研究，DP 表达的缺失与乳腺癌转移相关，DP 的表达与Ki-67 表达呈负相关趋势［11］，但迄今暂未查询到 DSG3 与Ki-67 表达关系的研究。本研究发现，DSG3 阳性组Ki-67 表达低于DSG3 阴性组，与上述研究结果大体相一致，这提示DSG3 表达阳性的NSCLC 患者预后较阴性组好。但值得注意的是，Ki-67 并不是影响NSCLC 患者预后的独立因素，由于其本身和肿瘤的病理类型、临床分期和组织学分级等与肿瘤预后因素有一定的相关性［12］。

DSG3 广泛分布在皮肤、食管、直肠、肺等器官，它是自身免疫性疾病天疱疮的自身抗原，天疱疮患者体内含有针对DSG3的抗体，由于DSG3是上皮细胞间连接的重要结构，DSG3表达的缺失可导致角质形成细胞桥粒间隙增加，因此出现上皮棘层细胞松解和水疱形成［13］。由于其自身结构和功能特点，DSG3在肿瘤细胞中的异常表达必然与肿瘤转移和患者预后相关，但DSG3 的作用是致癌还是抑癌，众多研究结果并不一致［14］。本研究用免疫组织化学方法检测DSG3 在肺鳞状细胞癌和肺腺癌组织中的表达，结果发现DSG3 阳性表达率在鳞癌组明显高于腺癌组，这可能与DSG3 是鳞癌组织特异性标志物有关。本研究选取了与肿瘤预后相关的一些指标包括年肿瘤大小、分化程度和是否有淋巴结转移等，分析其是否与DSG3 的表达有相关性，结果显示DSG3的表达与肿瘤分化程度有关，肿瘤的分化程度越差，DSG3 的阳性表达率越低，这与一些研究结果相同［15-16］。Xin 等［17］在研究口腔鳞癌 DSG3 的异常表达时，发现DSG3表达减少与肿瘤分化差、淋巴结转移率高等肿瘤恶性行为相关。本研究结果还显示，无淋巴结转移时DSG3阳性表达率显著高于有淋巴结转移。根据以上统计结果提示DSG3表达阳性预示肿瘤分化程度较好，出现淋巴结转移的概率低，预后好于DSG3阴性表达者。

为进一步明确DSG3的预后意义，我们就患者的总生存期进行了回访，统计结果显示NSCLC 患者的总生存期在DSG3 阳性组和DSG3 阴性组差异无统计学意义。分析原因：一是癌症的发生发展是由多因素共同参与，虽然DSG3的表达影响肿瘤的分化和进展，但在患者的预后方面它可能不起决定性作用，因此DSG3的表达状态对患者的总生存期没有影响；二是近年来的分子靶向治疗主要针对肺腺癌患者，如EGFR 阳性突变患者其在应用靶向药物后生存期较使用普通化疗方案患者生存期可延长3～4 倍［18］，而DSG3 表达阳性率，肺鳞状细胞癌高于肺腺癌，并且靶向治疗在肺鳞状细胞癌患者中研究应用少，所以分子靶向治疗方案的应用延长了肺腺癌患者的总生存期，从这一点上不能明确说明DSG3是否影响患者的预后。

综上所述，本研究从临床病理特征和与Ki-67 相关性表达两个方面上说明DSG3 的表达状态对NSCLC 患者的预后有一定影响，但也有研究显示不同的结果，认为NSCLC患者DSG3 表达阳性预示不良的预后［19］。NSCLC 患者生存率较低的原因是肺癌确诊较晚，有些难以有明确的病理诊断导致错过最佳治疗时机，缺少明确判断预后和监测治疗反应的标志物，DSG3既可以辅助病理医生明确诊断肺癌的病理类型，又可以辅助临床医生判断患者预后，从而指导治疗，所以DSG3不失为一个重要的肿瘤标志物。在下一步的工作中我们需要做进一步的相关研究，在研究对象的选择上入组标准更加统一化，并且扩大样本量，以得出明确结论。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。