利拉鲁肽对人胰岛淀粉样多肽聚集性及胰岛细胞毒性的影响

赵夕琛，靳育静，孙晓薇，李代清，朱铁虹

（1.天津医科大学总医院内分泌与代谢科,天津300052；2.天津医科大学朱宪彝纪念医院代谢病科,天津300134）

人胰岛淀粉样多肽（hIAPP）是胰岛β细胞分泌的淀粉样物质，也称为人胰淀素[1-3]。已有研究表明，hIAPP聚集过程的中间产物对胰岛细胞具有毒性作用，且为2型糖尿病患者胰岛细胞功能异常及凋亡的主要原因之一[4-7]，而临床上尚缺乏能有效抑制hIAPP聚集的药物。最近研究表明，利拉鲁肽可以减少阿尔兹海默病模型鼠脑内的Aβ淀粉样蛋白沉积与相关炎症反应，改善鼠的记忆功能[8-9]。Aβ与hIAPP具有相似的二级折叠结构与致病机制。因此本研究主要探讨利拉鲁肽是否可以通过抑制hIAPP聚集并减少hIAPP相关的胰岛细胞损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物 250～300 g雄性Wistar大鼠购自中国人民解放军医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心，动物级别为SpF级。

1.2 主要试剂 胶原酶（Ⅴ型）、hIAPP购自Sigma公司；Annexin-V/PI荧光染色试剂盒购自万类生物有限公司；利拉鲁肽注射液由诺和诺德公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 硫磺素T实验 新鲜配置硫磺素T、hIAPP的母液，分别为1 mmol/L与100μmol/L。在黑色96孔酶标板中，每孔中加入相应体积的母液和PBS缓冲液构建100μL反应体系：硫磺素T终浓度为10μmol/L，hIAPP终浓度为5μmol/L，单独或联合相应浓度利拉鲁肽（500 nmol/L和5μmol/L）共同孵育。酶标板中的体系液按照上述比例配置完毕后，置于全波长扫描多功能读数仪上，37℃孵育。每5 min摇10 s，静置10 s后读数，记录在440 nm激发波长和485 nm发射波长下的荧光强度。每组设立4个复孔，本底孔为未加药物仅含硫磺素T的检测液，各组最终荧光强度为实测荧光数值与本底孔荧光数值的差值。

1.3.2 磷钨酸负染滴染法电镜实验 于EP管中分别配置3组体系：20μmol hIAPP（人胰淀素）、20μmol hIAPP和2μmol利拉鲁肽、20μmol hIAPP和20μmol利拉鲁肽。将反应液室温过夜后，在37℃温箱中孵育2 h后，取20μL待检测的孵育样品滴在200目-碳包铜网上，静置3 min，用滤纸从铜网周边小心吸干未吸收的样品，再用200μL 1%磷钨酸溶液染色3 min，之后用滤纸吸干铜网周边多余染液，室温晾干或白炽灯下烤干后利用透射电子显微镜（Hitachi-HT7700）在180 KV加速电压下检测各组胰淀素淀粉样纤维形成情况。

1.3.3 大鼠胰岛分离与培养 10%水合氯醛经腹腔注射麻醉Wistar大鼠，以75%乙醇消毒皮肤，无菌剖腹，从胆总管进针，逆行缓慢注入4℃预冷的胶原酶p（0.8 g/L）8～10 mL，使胰腺充分膨胀。剪心放血处死大鼠，剥离出胰腺组织，快速将完整胰腺放入含有3 mL 4℃预冷胶原酶p的50 mL离心试管中。37℃水浴消化10~15 min，振荡使其呈细砂状，加入4℃含10%新生牛血清（FBS）的Hanks液约30 mL，终止消化，冰浴5 min待静置分层后小心吸弃上层液体，再次加入40~50 mL冰Hanks液，重复2次。于体视镜下手工挑取形状规则的圆形或椭圆形的胰岛细胞团。最后将分离纯化好的胰岛细胞团加入含有100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、10%胎牛血清、10 mmol/L Hepes、11.1 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养液中，5%CO2、37℃培养箱中培养。

1.3.4 采用台盼蓝以染色鉴定胰岛的活性 在96孔板中将0.4%的台盼蓝溶液与含有胰岛细胞的培养基1∶9混合，10 min内镜下观察细胞死亡情况。细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内。死亡细胞被染成蓝色，活细胞不着色。

1.3.5 细胞分组 将获取的胰岛简单随机化分为3组，每组15个胰岛：空白对照组（NC）；胰淀素组（10μmol/L hIAPP）；胰淀素+利拉鲁肽组（10μmo/L hIAPP+100 nmol/L Lira）。

1.3.6 Annexin-V/PI荧光染色法检测胰岛细胞的凋亡 按照试剂说明，配好Annexin-V/PI凋亡染色液（250μL Binding buffer，5～10μL Annexin V-FITC，10μL propidium Iodide），加入到干预12 h后的胰岛中，室温避光孵育15 min，随即进行荧光显微镜观察。正常活细胞无着色，细胞的早期凋亡呈绿色荧光，细胞晚期凋亡与坏死红色荧光。用Imageproplus7.0软件分析计算细胞凋亡的比率。

1.3.7 实时荧光定量检测mRNA表达水平 胰岛细胞处理完成后，Trizol法提取胰岛的RNA，根据Thermo First Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录反应，合成cDNA第1链。然后采用荧光法进行RT-PCR扩增反应，所用试剂盒为生工Sybr-Green qPCR Master Mix（2×）。按照说明书完成体系后瞬时离心，放入罗氏LightCycler96荧光定量PCR仪进行PCR扩增。结果采用2-△△CT相对定量比较，以β-actin为内参照基因进行标准化[10]，见表1

表1 PCR中基因引物序列Tab 1 Primer sequencesof genesin the PCR

1.4 统计学处理 采用SPSS22.0软件分析，正态分布的计量资料采用±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验，3组以上组间比较采用单因素方差分析LSD法检验。非正态分布的计量资料采用Kruskal-Wallis H秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 利拉鲁肽对hIAPP聚集的影响

2.1.1 硫磺素T实验结果 5μmol/L胰淀素单独孵育时，荧光于1.6 h左右开始上升，并逐渐增加，3.4 h后平稳。动力学曲线呈“S”型。5μmol/L胰淀素与500 nmol/L的利拉鲁肽（浓度比10:1）共同孵育后，荧光信号直到2.5 h后才开始上升，出现延迟。5μmol/L胰淀素与5μmol/L利拉鲁肽（浓度比1:1）孵育后，几乎检测不到胰淀素的聚集信号。胰淀素的聚集信号减弱，未见明显上升（图1）。

图1 硫磺素T染色实验结果Fig 1 Reswltsof thioflavin T assays

2.1.2 透射电镜结果 20μmol hIAPP单独孵育可见大量纤维状聚集物质，表明其聚集性良好（图2A）；但是20μmol hIAPP和2μmol利拉鲁肽（浓度比10∶1）共同孵育后纤维数量明显减少，并且聚集物形态较模糊且短小（图2B）；20μmol hIAPP和20μmol利拉鲁肽（浓度比1∶1）共同孵育后，无法找到hIAPP所聚集的纤维装结构（图2C）。

2.2 胰岛分离后的活性检测 台盼蓝染色结果如图3所示：新分离的胰岛细胞团大小不一，呈圆形或卵圆形，大多数胰岛细胞团胞膜完整，折光性好。胰岛分离过夜后，台盼蓝染色显示胰岛细胞膜完整活力良好。

图3 正常胰岛与台盼蓝染色后细胞形态Fig 3 The natural islet and cell morphology after Trypan blue excluding test

2.3 不同干预组胰岛细胞炎症相关因子的表达与分泌 荧光定量结果如图4所示：与空白对照组相比，胰淀素组的白细胞介素（IL）-1、肿瘤坏死因子（TNF）、单核细胞趋化蛋白-2（CCL-2）基因的mRNA表达均增加，分别为3.65±0.14、2.41±0.29、3.65±0.44；利拉鲁肽干预后IL-1、TNF、CCL-2基因的mRNA表达均下降，分别为1.44±0.12，1.36±0.18，1.33±0.17，差异具有统计学意义（F=429.68、48.79、153.39,P均＜0.05），见表2。

图4 不同干预组炎症相关基因IL-1、TNF、CCL-2 mRNA的表达Fig 4 ThemRNA expression of theinflammatory factors,including IL-1,TNF and CCL-2 in different group

2．4 同干预组胰岛细胞凋亡及凋亡相关基因表达的变化 Annexin-V/PI荧光染色如图5A所示，10μmol的hIAPP干预24 h后，胰岛细胞凋亡增加了22.9倍（17.16%vs.0.75%）；利拉鲁肽干预后凋亡显著减少（3.33%vs.17.16%），差异具有统计学意义（F=514.34，P＜0.05）。

RT-PCR结果如图5B所示：与空白对照组相比，胰淀素组促凋亡基因Bax mRNA相对表达量增加（1.21±0.05 vs.1.00±0.05），抗凋亡基因Bcl-2 mRNA相对表达量显著下降（0.51±0.12 vs.1.00±0.09），差异具有统计学意义（P均＜0.05）；与胰淀素组相比，利拉鲁肽组Bax mRNA表达没有减少（1.20±0.05 vs.1.21±0.05），抗凋亡基因Bcl-2表达增加（0.78±0.08 vs.0.51±0.12），差异具有统计学意义（P均＜0.05），见表2。

表2 各组胰岛细胞凋亡相关基因的变化（±s）Tab 2 Comparison of apoptosisrelated genesin each groups（±s）

表2 各组胰岛细胞凋亡相关基因的变化（±s）Tab 2 Comparison of apoptosisrelated genesin each groups（±s）

注：IL-1:白细胞介素-1；TNF:肿瘤坏死因子；CCL-2:单核细胞趋化蛋白-2；NC:空白对照组；hIAPP:胰淀素组；hIAPP+Lira：胰淀素+利拉鲁肽组

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图5 各组细胞凋亡情况Fig 5 Theapoptosisof each groups

3 讨论

本研究结果提示hIAPP本身具有聚集性，并且与胰岛细胞共同孵育时，促进炎症因子表达、细胞凋亡，以上均表明hIAPP对胰岛细胞的毒性作用，与之前研究一致[3，11]。利拉鲁肽可以浓度依赖性抑制hIAPP自我聚集，并且与hIAPP共同孵育胰岛细胞时，炎症与细胞凋亡减少，对胰岛细胞具有一定保护作用。

与糖尿病类似，阿尔兹海默病的是一种蛋白沉积性疾病，其主要构成成分为Aβ多肽，导致靶器官的损害。最近，在阿尔兹海默病的实验研究中发现：利拉鲁肽的早期干预可以减少Aβ寡聚体水平，减少阿尔兹海默病模型鼠脑内斑块样沉积，从而改善鼠的记忆功能[12]。Park等[13]以人胰岛为体外模型发现，胰高血糖素样肽（GLP）-1类药物可以使胰岛淀粉样寡聚体及蛋白的沉积减少。利拉鲁肽是否可以直接通过抑制多肽的自我聚集或改变其动力学曲线，减少寡聚体的数量或其纤维形成尚不清楚。本研究采用硫磺素T荧光实验观察hIAPP的聚集动力学，该聚集性试验参照IAPP相关分子抑制实验采用常规比例[14-15]，细胞实验采用利拉鲁肽常用细胞学浓度[16-17]，发现胰淀素与利拉鲁肽以10:1分子浓度共同孵育时，胰淀素聚集过程延缓，提高利拉鲁肽浓度（1:1）后，胰淀素未出现明显聚集，动力学曲线由S型变为直线型。并且进一步透射电镜的实验结果同样显示了利拉鲁肽可以浓度依赖性抑制hIAPP自我聚集的作用：利拉鲁肽与人胰淀素共同孵育后纤维数量明显减少。提示利拉鲁肽抑制了hIAPP的聚集。研究显示艾塞那肽不能抑制胰淀素聚集[18]，利拉鲁肽与其不同的是分子中独特的疏水作用脂肪酸侧链[19]，或许使其具有抑制胰淀素聚集潜能。进一步的分子结构相互作用的研究将有助于胰淀素自我折叠过程的理解以及抗聚集类药物的研发。

本课题组既往研究显示：hIAPP造成的胰岛细胞凋亡与炎症损伤有关,IL-1信号通路在其中发挥了重要作用[11]。利拉鲁肽可以减少阿尔兹海默病的β-淀粉样斑块相关的炎症损伤[8-9]。本次实验结果显示在利拉鲁肽与hIAPP共同孵育时，IL-1、TNFα、CCL-2炎症因子表达下降。既往细胞学、动物学及临床试验也表明利拉鲁肽具有一定抗炎作用。利拉鲁肽可以与GLP-1受体结合，通过激活细胞内PKA通路减少炎症因子的表达，从而起到细胞保护作用[20]。然而，本研究发现在体外相对独立环境下，利拉鲁肽可以直接抑制胰淀素的聚集，因此减少hIAPP聚集过程的毒性产物也许是利拉鲁肽发挥细胞保护作用的重要原因之一。

本实验中经hIAPP孵育后，胰岛细胞凋亡比率增加，Bax mRNA表达增加，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达下降。提示胰淀素导致细胞凋亡增加。hIAPP可改变细胞膜的通透性，增加内质网应激以及激活降钙素受体等影响胰岛细胞的功能及存活[4、21-22]。利拉鲁肽孵育后，除炎症因子表达下降外，抗凋亡基因Bcl-2表达增加，细胞凋亡比率减少。hIAPP相关的细胞损伤作用与其聚集性密切相关，利拉鲁肽是否直接通过抑制其聚集发挥作用或间接通过抗炎等机制保护胰岛细胞尚需要更深入研究。

总之，hIAPP可以造成胰岛细胞炎症损伤，增加胰岛细胞凋亡，利拉鲁肽可直接抑制胰淀素聚集，并减少IL-1、TNFα、CCL-2炎症因子表达，增加Bcl-2抗凋亡基因，发挥胰岛细胞保护作用，为利拉鲁肽与淀粉样沉积物间的关系提供基础研究证据及新思路。