LncRNA FAS-AS1在脑胶质瘤中的表达及与临床病理参数和预后的关系

姚俊朝, 张祥, 王垒垒, 金治宾, 张艳艳

脑胶质瘤(glioma)起源于神经上皮细胞,是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,其发病率约占颅内中枢神经系统恶性肿瘤的45%[1]。目前脑胶质瘤的治疗方法以手术切除为主,结合术后化疗、放疗等辅助治疗。然而由于脑胶质瘤具有侵袭性强、易复发等特点,手术切除难以彻底清除肿瘤,总体治疗效果不佳,且预后较差[2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA,与肿瘤的发生、发展关系密切。研究表明,反义LncRNA(Antisense LncRNA)可通过转录及转录后修饰等多层面参与调控细胞生长、分化及死亡等多种生理病理进程[3-4]。FAS-AS1(antisense transense of FAS)是一个位于Fas基因1号内含子反义链上的反义LncRNA,其在正常成人心脏、肝脏、胰腺等多种组织中表达上调。有研究显示,反义LncRNA FAS-AS1在乳腺癌组织及乳腺癌细胞中的表达分别低于正常乳腺组织及正常乳腺细胞,且对宿主基因Fas的表达及乳腺癌细胞的增殖能力有一定影响作用[5]。但其在脑胶质瘤组织中的表达情况,目前尚鲜有报道。本研究通过检测脑胶质瘤组织中LncRNA FAS-AS1的表达情况,以期探讨其与脑胶质瘤患者临床病理参数及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2015年1月至2016年12月在我院就诊的58例脑胶质瘤患者为研究对象,其中男35例,女23例,年龄25～70岁,平均(46.24±12.25)岁。按照世界卫生组织(WHO)神经系统肿瘤分级标准分为:Ⅰ级8例,Ⅱ级11例,Ⅲ级30例,Ⅳ级9例。病理类型为:星型细胞瘤28例,少突胶质细胞瘤18例,其他12例。纳入标准:①符合2018年脑胶质瘤诊疗规范[6]中脑胶质瘤的标准;②首次经镜下手术全切除治疗;③术前未经放、化疗及其他辅助性治疗。排除标准:①患有精神疾病患者;②患有传染性疾病患者。另择同期因颅脑外伤而行手术治疗的患者42例为对照组,其中男22例,女20例,年龄26～70岁,平均(47.05±12.21)岁。两组患者性别(χ2=0.347,P=0.556)、年龄(t=0.327,P=0.745)比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准,患者均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 根据影像学摄片(CT或MRI)判断肿瘤部位、肿瘤直径、瘤周脑水肿(Peritumoral vasogenic brain edema,PTBE)的分类及病理分级,参照WHO的分类标准[7]。

其中PTBE的严重程度根据MRI诊断显示水肿最明显及肿瘤直径最大的平面上测到的水肿带宽度进行评估,用水肿指数EI进行表示,即T2加权图像瘤周水肿的最大直径和相应层面肿瘤最大直径比,或增强CT扫描显示低密度的瘤周水肿的最大直径与相应层面肿瘤最大直径的比值。当EI=1时说明无瘤周水肿,EI>2为重度水肿,1

1.2.2 主要试剂及仪器 RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒及miScript SYBR Green PCR Kit均购自天根生化科技(北京)有限公司。飞利浦16层Brilliance CT购置荷兰飞利浦公司,GE1.5T及3.0T超导型磁共振扫描仪购置美国GE公司。

1.2.3 样本采集与保存 取脑胶质瘤患者及颅脑外伤患者手术切除后的脑胶质瘤组织及正常脑组织,并及时将其保存于-80 ℃液氮中待测。

1.2.4 采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测LncRNA FAS-AS1的表达 将脑胶质瘤组织及正常脑组织放入研钵,加入液氮,迅速进行研磨,采用Trizol法提取脑胶质瘤组织及正常脑组织中的总RNA,采用蛋白核酸分析仪检测其浓度及纯度,采用反转录试剂盒反转录RNA得cDNA,以该cDNA为模板,按miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒说明书配制20 μl反应体系进行RT-qPCR实验。反应条件:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环,72 ℃延伸5 min。LncRNA FAS-AS1及内参GAPDH的引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法对LncRNA FAS-AS1的表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 随访 自患者出院之日起,对患者进行门诊复查或者电话随访,随访时间为2年,记录患者的生存情况,以患者死亡、失访或最近一次随访时间为终点。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 脑胶质瘤组织及正常脑组织中LncRNA FAS-AS1的表达情况

脑胶质瘤组织及正常脑组织中LncRNA FAS-AS1的表达水平分别为1.01±0.32、2.05±0.21,脑胶质瘤组织LncRNA FAS-AS1的表达水平低于正常脑组织(t=7.544,P<0.05)。

2.2 LncRNA FAS-AS1与脑胶质瘤临床病理参数的关系

以脑胶质瘤组织中LncRNA FAS-AS1表达水平的均值为界,将脑胶质瘤分为低表达组(26例)与高表达组(32例)。LncRNA FAS-AS1低表达组患者肿瘤直径>3 cm、病理分级Ⅲ～Ⅳ级、重度PTBE比例高于高表达组(P<0.05),性别、年龄、肿瘤部位、病理类型与高表达组差异均无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 不同LncRNA FAS-AS1表达组与脑胶质瘤临床病理参数的关系 [例(%)]

2.3 LncRNA FAS-AS1表达水平与脑胶质瘤患者预后的关系

所有患者均获随访,平均随访时间为(20.51±2.24)个月。本组患者中有28例死亡,2年生存率为51.72%,中位生存时间为(16.42±2.63)个月。其中LncRNA FAS-AS1低表达患者2年生存率为30.77%,显著低于高表达患者的68.75%(Log-rankχ2=7.674,P<0.05),见图1。

图1 LncRNA FAS-AS1表达水平与脑胶质瘤患者预后的关系

2.4 影响胶质瘤患者预后因素的Cox回归分析

以LncRNA FAS-AS1表达、PIBE、病理分级、肿瘤直径为自变量,以脑胶质瘤患者预后(生存=0,死亡=1)为因变量,进行多因素Cox回归分析,结果显示,LncRNA FAS-AS1低表达、病理分级Ⅲ～Ⅳ级、重度PIBE是影响脑胶质瘤患者预后的危险因素,见表3。

表3 脑胶质瘤患者预后的多因素Cox回归分析

3 讨论

脑胶质瘤细胞最大的生物学特性是细胞呈浸润生长,临床诊断及分级准确度低,手术清除困难,术后容易复发,尽管现代临床治疗方式已由单一手术治疗转变为以手术为主,结合术后化疗、放疗的综合治疗方式,然而脑胶质瘤患者的治愈率并未得到明显改善,术后复发率及病死率依然较高[8-9]。因此寻找可早期预测脑胶质瘤预后情况的生物学指标,对改善患者生存情况具有重要意义。

LncRNA具有多种生物活性,参与细胞分化、胚胎与组织发育等生物学过程,且在肿瘤发生发展及神经代谢疾病中发挥重要的功能[10]。目前已发现LncRNA MEG3等多种LncRNA可能在胶质瘤的发病机制中起关键的调控作用[11]。反义LncRNA是一类基因序列与宿主基因mRNA互补,转录方向与其相反的LncRNA分子。LncRNA FAS-AS1是一个位于Fas基因1号内含子反义链上的反义LncRNA,在B细胞淋巴瘤患者淋巴瘤细胞及外周血中表达异常下调[12]。有研究证实,B淋巴细胞瘤中,FAS-AS1可与RBM5结合并相互作用,进而影响Fas基因6号外显因子的转录,对sFas表达产生抑制作用[13]。本研究结果显示,脑胶质瘤组织中LncRNA FAS-AS1的表达水平显著低于正常脑组织,提示LncRNA FAS-AS1在脑胶质瘤组织中表达下调,可能在肿瘤发生中扮演抑癌基因的角色,参与脑胶质瘤的发生。本研究进一步分析脑胶质瘤组织中LncRNA FAS-AS1的表达水平与患者临床病理参数的关系,结果显示,LncRNA FAS-AS1低表达组患者肿瘤直径>3 cm、病理分级Ⅲ～Ⅳ级比例高于高表达组,推测原因可能是一方面LncRNA FAS-AS1可分泌至血液中造成肿瘤细胞的迁移、侵袭,导致肿瘤直径加大,病理分级加重;另一方面,肿瘤直径越大,病理分级越严重,又可能导致合成和释放的LncRNA FAS-AS1越少,进一步提示LncRNA FAS-AS1可能参与脑胶质瘤的发生发展。PTBE是脑胶质瘤影像学检测中常见的表现,其主要是由于肿瘤内毛细血管内皮结构及功能改变,或因生化因子对血流屏障及血脑屏障产生损害,而造成蛋白外渗、血管通透性增加,导致液体聚集在肿瘤间质或肿瘤周围脑实质中而形成。本研究中LncRNA FAS-AS1低表达组患者重度PTBE比例高于高表达组,推测可能与脑胶质瘤血管通透性的增加,而造成脑胶质瘤瘤周水肿,进而引起肿瘤周围脑组织扭曲,局部组织压升高,造成脑缺血、缺氧,患者严重程度加重有关。

临床数据表明,脑胶质瘤在成人患者中的中位生存期仅14.6个月[14],王莹等[15]从公用数据库中国脑胶质瘤基因组图谱计划中下载了包含B细胞淋巴瘤因子3(B-cell CLL/lymphoma 3,BCL3)基因表达及患者预后的胶质瘤患者数据,通过分析发现,低级别胶质瘤患者术后总生存期为0.03～211个月,中位生存期为23.19个月;胶质母细胞瘤患者术后总生存期范围为0.1～127.5个月,中位生存期为12.42个月。本研究对58例脑胶质瘤患者进行2年随访,死亡28例,2年生存率为51.72%,中位生存时间为(16.42±2.63)个月。其中LncRNA FAS-AS1低表达患者2年生存率为30.77%,显著低于高表达患者的68.75%,提示LncRNA FAS-AS1表达可能与脑胶质瘤患者预后有关,且LncRNA FAS-AS1的低表达提示预后较差。本研究进一步通过Cox模型分析显示,LncRNA FAS-AS1低表达、病理分级Ⅲ～Ⅳ级、重度PIBE是影响脑胶质瘤患者预后的独立危险因素,提示LncRNA FAS-AS1参与脑胶质瘤的发生发展,且可能成为脑胶质瘤患者不良预后的生物标记物之一。