痰咳净片质量标准改进研究

康小凤 南荣华 刘嘉澍 王梦琪 李 青 黄 艳

陕西省食品药品监督检验研究院中药室，陕西西安 710065

痰咳净片具有通窍顺气、消炎镇咳、促进排痰的功效，疗效显著，其处方是由桔梗、咖啡因、远志、冰片、苦杏仁、五倍子、甘草7味中药材组成，临床上用于急慢性支气管炎、胸闷、咽喉炎、肺气肿等引起的咳嗽痰多、气促、气喘等症状[1-3]。该品种现行质量标准只考察个别成分及企业的产品，为了更有效的控制质量，该品种被列为2018年度国家药品标准。故本研究收集了不同产地四家企业的产品，在对原有鉴别方法学验证的基础上，增加甘草、桔梗的薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）法鉴别，对含量测定进行方法学验证及修订。修订后的质量标准简单、准确、灵敏度高，能达到快速准确检测的效果，方法均经过耐用性的考察，为痰咳净片的质量控制提供了依据，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（型号：LC-30AD、四元梯度泵、紫外检测器）；高效液相色谱仪（型号：LC-2030C-3D、四元梯度泵、二极管检测器）；高效液相色谱仪（型号：Waters e2695-2489、四元梯度泵、紫外检测器）；高效液相色谱仪（型号：Agilent 1260、四元梯度泵、紫外检测器）；Empower工作站（美国沃特斯公司）；电子分析天平（德国Sartorius公司,型号：BP211D、BS224S、ME204）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司,型号：KH-300DE），OVENS 075台式干燥器等。

1.2 试验用药

冰片（批号：0992-200001）、五倍子（批号：121078-201504）、没 食 子 酸（批 号：110831-201204）、甘草（批 号：120904-201519）、桔 梗（批 号：121028-201612）、咖啡因（批号：110777-201711）、甘草酸铵（批号：110731-201720，纯度：97.7%），均购自中国食品药品检定研究院。痰咳净片及阴性样品由陕西委托方提供。硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂）；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；色谱乙腈（美国天地公司）、色谱甲醇（美国天地公司），水为优普超纯水；其他试剂均为分析纯，购自西安化学试剂厂。

2 TLC鉴别研究方法

2.1 甘草[4-6]

2.1.1 供试品溶液的制备 取本品15片，研细，取约2 g，加乙醚40 ml，加热回流1 h，滤过，弃去乙醚液，药渣挥去乙醚，加甲醇30 ml，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水40 ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，正丁醇液用水洗涤3次，每次20 ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。

2.1.2 对照药材溶液的制备 取甘草对照药材1 g，同2.1.1法制成对照药材溶液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 取甘草阴性对照2 g，同2.1.1法制成阴性对照溶液。

2.1.4 结果分析 按照TLC（《中国药典》2015年版四部 0502）试验，吸取 2.1.1、2.1.2、2.1.3项下溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与甘草对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰，斑点分离较好，方法基本可行。见图1。

图1 甘草的薄层色谱图

2.2 桔梗[7-9]

2.2.1 供试品溶液的制备 取本品25片，研细，取约 4 g，加水 20 ml，稀盐酸 6 ml，放置 30 min，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液用三氯甲烷振摇提取2次，每次20 ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。

2.2.2 对照药材溶液的制备 取桔梗对照药材1 g，同2.2.1法制成对照药材溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取桔梗阴性对照4 g，同2.2.1法制成阴性对照溶液。

2.2.4 结果分析 依据TLC（《中国药典》2015年版四部 0502）试验，吸取 2.2.1、2.2.2、2.2.3项下溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（3∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与桔梗对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，阴性无干扰，斑点分离较好，方法基本可行。见图2。

图2 桔梗的薄层色谱图

3 高效液相色谱含量测定研究方法

3.1 甘草酸的含量测定

3.1.1 色谱条件及系统适应性 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为4.6 mm×250 mm，内径5 m）；流动相：甲醇-0.2 mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸（65∶34∶1）；检测波长：250 nm；理论板数按甘草酸峰计算应不低于2000。

3.1.2 对照品溶液的制备 精密称取甘草酸铵对照品适量，加流动相制成每1 ml约含40 g的溶液，即得（相当于每1 ml含甘草酸39.18 g）。

3.1.3 供试品溶液的制备 取本品40片，精密称定，研细，取3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相50 ml，称定重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用流动相补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.1.4 专属性考察 取甘草阴性样品3 g，按3.1.3法制成阴性溶液，分别精密吸取3.1.2、3.1.3项下溶液及此阴性溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按3.1.1测定，结果阴性无干扰，表明方法专属性较强。见图3。

图3 甘草酸含量测定的HPLC图

3.1.5 线性关系考察 精密取每1 ml含甘草酸铵0.0455 mg 的甘草酸铵对照品 1 溶液 2、5、10、15、20、25 L及每1 ml含甘草酸铵0.0911 mg的甘草酸铵对照品2溶液15、20、25 L分别注入液相色谱仪，按3.1.1测定，以甘草酸铵的进样质量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，作标准曲线，计算甘草酸铵的回归方程为Y=794 996.5X（r=0.99 999，n=9），结果表明，甘草酸铵在进样质量为0.091～2.278 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

3.1.6 精密度考察 精密吸取甘草酸铵对照品溶液，注入液相色谱中，重复进样7次，按3.1.1测定峰面积和保留时间，结果RSD%分别为0.27%，0.05%（n=6），表明仪器精密度良好。

3.1.7 稳定性考察 取本品（批号：180801）按3.1.3 法制备、3.1.1 测定，分别在 0、2、6、11、16、24、35、42 h测定峰面积，结果RSD%为2.38%（n=8），表明样品溶液在42 h内稳定性良好。

3.1.8 重复性考察 按3.1.3法制备样品（批号：180801），平行6份，按 3.1.1测定，结果RSD% 为2.51%，表明供试品重现性良好。

3.1.9 回收率考察 分别往具塞锥形瓶中精密量取甘草酸铵对照品（浓度为0.0869 mg/ml）溶液7 ml，平分6份，挥干溶剂，再取已知含量的样品（批号：180801，甘草酸铵含量为0.4316 mg/g）6份，精密称定，每份1.5 g，依法制备供试品溶液，测定，计算。结果平均回收率为96.98%，RSD为2.88%，表明回收率良好。

3.1.10 样品含量测定 按4.1.1色谱条件，取12批次样品照3.1.3法制备供试品溶液，精密吸取10 μl，注入高效液相色谱仪，测定。见表1。

表1 甘草酸含量测定结果

3.2 咖啡因的含量测定[10]

3.2.1 色谱条件及系统适应性 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为4.6 mm×250 mm，内径5 m）；流动相：甲醇-0.2 mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸（33∶66∶1）；检测波长：273 nm；理论板数按咖啡因计算应不低于2000。

3.2.2 对照品溶液的制备 精密称取咖啡因对照品适量，加水制成每1 ml约含50 g的溶液，即得。

3.2.3 供试品溶液的制备 取本品20片，精密称定，研细，取0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水100 ml，称定重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，置50 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

3.2.4 专属性考察 取咖啡因阴性样品0.5 g，按3.2.3法制备阴性对照溶液，分别精密吸取3.2.2、3.2.3项下溶液及此阴性对照溶液各10 μl，注入液相色谱仪中，按3.2.1测定，结果阴性对照无干扰，表明方法专属性较强。见图4。

图4 咖啡因含量测定的HPLC图

3.2.5 线性关系考察 精密取每1 ml含咖啡因0.04 524 mg 的咖啡因对照品溶液 5、8、10、12、15、18、20 μl注入液相色谱仪，按3.2.1测定，以咖啡因的进样质量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，作标准曲线，计算咖啡因的回归方程为Y=1519 520X（r=0.99 999，n=7），结果表明，咖啡因在进样质量为0.2262～0.9048 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

3.2.6 精密度考察 精密吸取咖啡因对照品溶液，注入液相色谱中，重复进样7次，按3.2.1测定峰面积和保留时间，结果RSD%分别为0.04%，0.00%，表明仪器精密度良好。

3.2.7 稳定性考察 取本品（批号：180801）按4.3.3 法制备、4.3.1 测定，分别在 0、2、4、6、8、16、24、36、48 h测定峰面积，结果RSD%为0.10%，表明样品溶液在48 h内稳定性良好。

3.2.8 重复性考察 按3.2.3法制备样品（批号：180801），平分 6份，按 3.2.1测定，结果RSD% 为1.18%，表明供试品重现性良好。

3.2.9 回收率考察 分别往具塞锥形瓶中精密称取咖啡因对照品约25 mg，平分6份，再取已知含量的样品（批号：180801，咖啡因含量为96.1400 mg/g）6份，每份0.25 g，依法制备供试品溶液，测定，计算。结果平均回收率为98.21%，RSD为1.77%，表明回收率良好。

3.2.10 样品含量测定 按3.2.1色谱条件，取12批次样品照3.2.3法制备供试品溶液，精密吸取10 μl，注入高效液相色谱仪，测定。见表2。

表2 咖啡因含量测定结果

4 讨论

本研究对方中苦杏仁[10]、远志[11]药材进行了TCL鉴别，采用不同的提取方法及展开剂，结果特征性不强，斑点模糊、阴性有干扰等，故未收入标准中，需进一步研究。

本研究对含量测定方法进行验证，考察耐用性，分别采用不同柱温、色谱柱、液相色谱仪进行考察。对同一批样品甘草酸含量的考察：柱温分别在30、35、40℃时，对分离效果影响不大，含量RSD为0.63%，仅对保留时间有影响；分别采用Phenomenex、Agilent、SPOLAR C18品牌色谱柱，岛津 LC-30AD、LC-2030C-3D、Waters e2695-2489型号仪器，含量RSD为2.59%；对同一批样品咖啡因含量的考察[12]：柱温分别在30、35、40℃时，对分离效果影响不大，含量RSD为0.78%，仅对保留时间有影响；分别采用Phenomenex、Agilent品牌色谱柱，岛津LC-30AD、LC-2030C-3D、Waters e2695-2489型号仪器，含量RSD为1.10%；故采用不同色谱柱、仪器对测定结果影响不大，说明该方法耐用性良好。

桔梗为方中的君药用量较大，其宣肺利咽，祛痰排脓的功能与成药功能密切相关，且有研究表明，桔梗中起镇咳作用的活性成分之一是桔梗皂苷D[13]。故本研究对方中桔梗中桔梗皂苷D采用不同的提取方法[3，14-15]，进行检测分析，四个不同厂家的四批样品桔梗皂苷D的含量均小于万分之一，故暂不列入标准正文，需进一步研究。

综上所述，本研究建立的方法符合制剂质量标准建立的要求，方法简便、快捷、重现性较好、限度合理，对痰咳净片的用药安全和质量控制具有重要的指导作用。