640 nm红光照射对人真皮成纤维细胞增殖的时间剂量依赖性效应及对TGF-β相关基因mRNA表达的影响

易 斌 郭庆霞 何 军 韩克影 凡静静

1.北京创盈光电医疗科技有限公司，北京 100176；2.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206

妊娠纹是由于孕期腹部隆起后皮肤出现的波浪状花纹，分娩后花纹逐渐消失形成有光泽的瘢痕线纹，即妊娠纹[1]。妊娠纹严重影响女性的皮肤美观，因此受到社会广泛的关注。妊娠纹的治疗主要包括药物治疗、激光治疗、微创手术治疗、红光治疗等[2-3]，但是目前无明确的治疗方法。妊娠纹产生的机制涉及内分泌调控、遗传基因易感性以及表皮细胞的增殖等[4-5]，但是最终的调控核心是皮肤中胶原纤维和弹力纤维的减少及断裂[6-7]。皮肤被拉伸形成妊娠纹的过程中，拉伸力使成纤维细胞收缩衍变成肌纤维母细胞[8]。妊娠纹的肌纤维母细胞处于静止状态，不能合成胶原蛋白和弹性蛋白[9-10]。因此妊娠纹的治疗主要调控成纤维细胞促进胶原纤维和弹性纤维的表达。红色光波一般介于600～700 nm，红光治疗主要依赖光化学作用，而不是能量作用[3]。目前红光治疗主要应用于消炎、加速组织修复、促进骨折愈合、淡化瘢痕等领域[11-12]。640 nm主要应用于皮肤治疗领域。妊娠纹是皮肤损伤后留下的痕迹[13]，而640 nm红光治疗妊娠纹的作用机制不明确。本研究将采用不同强度（时间）的640 nm红光照射人真皮成纤维细胞，检测细胞的增殖和凋亡，同时检测转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）、胶原（collagen，Col）、Smad2和Smad3的基因表达，为640 nm红光治疗妊娠纹提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞 人真皮成纤维细胞（SCIENCEL）

1.1.2 实验试剂 成纤维细胞培养基（诺唯赞生物科技股份有限公司，R401-01）、吉姆萨染色液（索莱宝，G1015）、台酚蓝染色液（索莱宝，C0040）、胰酶 -EDTA（索莱宝，T1300）、噻唑蓝（GIBICO，M6494）、Trizol（ThermoFisher，15596026）、反转录试剂盒（ThermoFisher，4368813）、ABsolute Blue QPCR Mix、SYBR Green、Low ROX（ThermoFisher，AB4323A），其他化学试剂为国药产品。

1.1.3 实验材料 6孔板（康宁）、96孔板（康宁）、PCR八连管。

1.1.4 实验仪器 二氧化碳培养箱（SANYO，MC0-15AC）、生物安全柜（海尔，HR40-IIA2）、离心机（北京时代北利离心机公司，D75-2B）、酶标仪（Thermo Fisher，MULTISKAN FC）、显微镜（北极光普佳科技有限公司，IM200）、PCR仪（北京东胜创新生物科技有限公司，ETC811）、荧光定量PCR仪（ABI，Step One）。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏及传代 复苏的细胞37℃水浴锅中轻晃融化，转入含有10 ml DMEM的离心管；1000 r/min离心5 min，倒掉上清液后，离心管中加培养基混悬后转移至培养瓶；细胞增殖到80%密度传代。

1.2.2 细胞照射 待细胞培养至第三代后，分组进行640 nm、25 mW/cm2红光照射，分别以不同的照射时间（30、60、120 min）对培养孔进行非重叠照射，每天照射一次，同时设定无照射组进行对照比较。照射不同时间后，继续培养细胞，于 12、24、36、48、60、72 h收集细胞进行细胞活性、细胞数量和基因表达水平的检测。

1.2.3 荧光染色 细胞爬片用PBS浸洗3次，3 min/次；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗 3次，3 min/次；0.5% TritonX-100透化 20 min，PBS浸洗3次，3 min/次；山羊血清室温封闭30 min，一抗（Vimentin）4℃孵育过夜；PBST浸洗3次，3 min/次，荧光（Cy3）标记羊抗兔 IgG，孵育 1 h，PBST浸洗3次，3 min/次；DAPI复染核后封片，并观察采集图像。

1.2.4 噻唑蓝（MTT）检测 细胞培养1 d后，640 nm红光照射分别照射30、60、120 min；对辐照后每组的 12、24、36、48、60、72 h 时间段进行检测，弃掉上清，添加5 mg/ml无菌MTT溶液20 μl，继续培养4 h。终止培养，吸弃孔内培养上清溶液，每孔添加150 μl无菌DMSO溶液，震荡10 min左右，使结晶物充分溶解。检测490 nm波长处吸光光度值，根据读数判断细胞增殖速度。

1.2.5 吉姆萨染色 细胞接种在六孔板的盖玻片，培养3 d后甲醇固定10 min，蒸馏水浸洗2次，3 min/次；滴加稀释好的吉姆萨染色液室温染色15～30 min；自来水缓慢冲洗晾干后镜检。

1.2.6 台酚蓝染色 细胞接种在六孔板，培养3 d后消化细胞制成细胞悬液；细胞悬液与0.4%台酚蓝溶液（9∶1）混匀，染色3～10 min；吸取少量染色细胞，用血细胞计数板计数。细胞存活率=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。

1.2.7 实时荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，RT-PCR）法检测 目的基因RT-PCR收集细胞，加入500 μl TRIZOL提取RNA，按照反转录试剂盒将RNA转录成cDNA，-20℃保存备用。目的基因扩增，配制RT-PCR反应液：2×mastermix（10.0 μl）、ForwardPrimer（1.0 μl）、ReversePrimer（1.0 μl）、Nuclease-free H2O（6.0 μl）。将 PCR 反应液分装于PCR八连管中，18 μl/管；加入2 μl制备好的cDNA；在荧光定量PCR仪上进行程序扩增（表1），检测基因的表达差异。基因溶解曲线用来指示扩增产物的特异性，基因循环数计算基因表达的相对含量。

2 结果

2.1 人真皮成纤维细胞的鉴定

荧光染色后，Vimentin染色阳性率＞90%，即细胞纯度＞90%，见图1。

图1 人真皮成纤维细胞荧光鉴定结果

2.2 不同强度的640 nm红光照射对人真皮成纤维细胞周期的影响

2.2.1 不同强度的640 nm红光照射对人真皮成纤维细胞增殖的影响 MTT实验结果显示，同对照组相比，30、60、120 min的照射强度在细胞生长的前期对细胞的活性影响不显著，但在细胞生长对数期影响显著，对照组和照射组均在生长60 h时达到了细胞活性的最高点，且照射组细胞活性显著高于对照组，照射120 min比照射30、60 min细胞活性更高。见图2。

图2 MTT活性检测细胞生长曲线图

2.2.2 不同强度的640 nm红光照射对人真皮成纤维细胞细胞形态及数量的影响 吉姆萨细胞染色结果显示，每组的细胞形态、状态良好，无显著差异，染色细胞密度显示30、60、120 min照射组细胞密度要大于对照组。见图3。

图3 各组培养不同时间染色

2.2.3 不同强度的640 nm红光照射对人真皮成纤维细胞生长周期的影响 36 h后照射组细胞数量显著多于对照组，且细胞生长60 h后逐渐进入细胞凋亡期，而对照组生长72 h还未进入细胞增殖的凋亡期，见图4。通过对细胞存活率计算，对照组无死亡细胞，而照射组细胞存活率下降，不同照射强度之间细胞存活率无显著差异，见图5。

图4 细胞计数生长曲线

图5 培养72 h后细胞存活率

2.3 不同强度的640 nm红光照射对人真皮成纤维细胞基因表达的影响

2.3.1 不同强度的640 nm红光照射对人真皮成纤维细胞TGF-β基因表达的影响 各组人真皮成纤维细胞TGF-β基因表达的比较，照射组48 h之前与对照组相比，TGF-β基因的表达降低，48 h之后表达逐渐升高，且照射60 min上调作用最为显著。见图6。

图6 不同照射强度对人真皮成纤维细胞TGF-β基因表达的影响

2.3.2 不同强度的640 nm红光照射对人真皮成纤维细胞COL基因表达的影响 同对照组相比，30 min和60 min照射组细胞COL基因表达升高，且其表达趋势与对照组一致，而120 min照射组与对照组相比也显著上调了细胞COL基因表达，且在照射48 h时细胞COL基因表达达到最高值，之后出现急剧下降。见图7。

图7 不同照射强度对人真皮成纤维细胞COL基因表达的影响

2.3.3 不同强度的640 nm红光照射对人真皮成纤维细胞Smad-2、Smad3基因表达的影响 不同强度640 nm红光照射对人真皮成纤维细胞Smad2基因的影响实验结果显示，照射30 min对人真皮成纤维细胞Smad2基因的表达无显著影响；照射60 min时，细胞生长24 h时Smad2基因的表达达到高峰；而照射120 min时，细胞生长12 h和24 h时Smad2基因的表达均显著高于对照组，36 h时达到最高点，之后开始急剧下降，可能是120 min照射强度增加了细胞毒效应。见图8。

图8 不同照射强度对人真皮成纤维细胞Smad2基因表达的影响

Smad3基因的表达结果显示，照射30 min和60 min，人真皮成纤维细胞Smad3基因表达上调；120 min照射组在细胞生长前期Smad3基因表达显著上调，48 h之后表达明显低于对照组，可能是120 min照射强度增加了细胞毒效应；照射60 min细胞生长周期内一直显著高于对照组。见图9。

图9 不同照射强度对人真皮成纤维细胞Smad3基因表达的影响

3 讨论

妊娠纹是由于女性怀孕过程胶原纤维牵拉断裂形成的皮肤瘢痕线纹，妊娠纹的发生率高达60%～90%，影响着大约4亿女性的正常生活[14]。妊娠纹的发生机制核心是胶原纤维和弹性纤维的减少，而成纤维细胞是其主要来源细胞[15]。因此，上调成纤维细胞的活性，促进胶原纤维和弹性纤维的生成是治疗妊娠纹的关键途径。妊娠纹的治疗方法包括药物治疗、手术治疗、激光治疗、射频治疗和红光治疗等[12，16]。640 nm红光属于中波段红光，其治疗妊娠纹的作用强度和对成纤维细胞的调控机制依旧不明确。所以，本研究选用不同强度的640 nm红光照射人真皮成纤维细胞，探究红光照射对细胞周期的影响以及对成纤维细胞基因表达的调控机制。

不同强度640 nm红光照射指数期的成纤维细胞，每隔12 h进行细胞活性及表达因子基因的检测，检测至照射后72 h。实验结果显示，与对照组相比，640 nm红光照射显著上调细胞的增殖活性和细胞数量。640 nm红光照射能促进成纤维细胞的增殖，从而增加生成胶原的细胞数量，促进胶原的产生，胶原的产生能修复妊娠纹。MTT活性结果显示，照射组细胞均在60 h时达到细胞生长的稳定期，72 h之后进入衰亡期，而对照组的MTT活性、细胞计数以及细胞存活率结果显示，对照组在60 h进入稳定期，72 h还未进入衰亡期，本实验结果表明640 nm红光照射可显著提升细胞的增殖活性，缩短细胞的生长周期。640 nm红光照射组和对照组细胞因子基因表达检测结果显示，640 nm红光照射显著上调了人真皮成纤维细胞TGF-β的表达，同时调控了胶原蛋白基因的表达上调，且照射60 min对细胞的增殖活性作用最显著。本研究需要进一步完善红光照射诱导胶原纤维生成的分子调控机制，为红光治疗妊娠纹提供强有力的理论基础。

综上，在本实验中发现640 nm红光照射疗法具有时间和剂量依赖性。60 min的红光照射时长，照射效应积累48～60 h时即可显著促进体外培养的人真皮成纤维细胞的增殖活性。本研究结果为640 nm红光治疗妊娠纹提供了理论基础。