巴氯芬人工抗原的合成及其鼠源多克隆抗体的制备

王 耀，曹金博，胡骁飞，段张秀，庞杏豪,，孟继秋,，孙亚宁，曹夕丹，陈秀金，李兆周

(1 河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2 河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；3 西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌712100；4 新乡市动物卫生监督所，河南 新乡 453003)

巴氯芬(baclofen，BA)又名氯苯氨丁酸，化学名为4-氨基-3-对氯苯基丁酸，是γ-氨基丁酸的一种衍生物，其化学结构式如图1所示。巴氯芬属于镇静剂类药物，可抑制单突触和多突触反射在中枢神经系统的传递，临床上多用于治疗中枢性痉挛性瘫痪、缓解肌张力障碍等[1-3]。将巴氯芬添加至饲料中，可抗热应激，增加采食量，促进畜禽生长、提高瘦肉率[4-5]。近年来在饲料安全监测工作中，发现有将巴氯芬作为传统瘦肉精替代物使用的情况[6-7]。但巴氯芬并非兽药或饲料添加剂，其在禽畜养殖过程中的非法使用，将导致动物性食品安全问题，危害人体健康，造成嗜睡、呕吐、眩晕、腹泻等症状，严重时可导致类似脑死亡的症状[8-10]。因此，建立针对巴氯芬的高效快速检测方法对于强化饲料安全监测、保障动物性食品安全具有重要的意义。

图1 巴氯芬化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of baclofen

目前，巴氯芬的检测方法主要有毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)[11]、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)[12]、液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS)[13]等。原农业部1862号和2349号公告发布的国家标准以及湖南省发布的地方标准(DB43/T 889-2014)中所规定的饲料中巴氯芬检测方法均采用了HPLC和LC-MS，此类检测方法准确度和灵敏度高，但检测仪器昂贵、样品前处理复杂、检测过程繁琐，局限于实验室精准检测，不适合批量样品快速筛查。相比之下，免疫分析技术利用抗体对抗原进行特异性识别，具有灵敏快速的优势，其中酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫层析检测(immunochromatographic assay，ICA)等方法在兽药残留、动物疫病筛查方面应用广泛[14-16]，但目前仍缺乏针对巴氯芬的免疫学快速检测方法。本试验合成巴氯芬人工抗原，用其免疫BLAB/c小鼠，制备巴氯芬鼠源多克隆抗体，并对其免疫学特性进行鉴定，旨在为巴氯芬免疫学快速检测方法的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试 剂 巴氯芬、γ-氨基丁酸、氯丙那林、可乐定、赛庚啶、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等标准品、1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、牛血清蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)，均购自美国Sigma公司；羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)，购自美国Abbkine公司；Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、KCl和NaHCO3等常用分析纯级试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪 器 BSA224S型电子天平(德国Sartorius公司)，Multiskan FC型酶标仪(美国Thermo Scientific公司)，Vortex 2型振荡器、T8.10高速均质乳化机(艾卡仪器设备有限公司)，SZCL-2型控温磁力搅拌器(巩义予华仪器有限公司)，HPX-9052MBE型恒温培养箱(上海博迅实业有限公司)。

1.1.3 试验动物 6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，购自河南省实验动物中心。

1.2 巴氯芬人工抗原的合成

采用EDC法[17]合成巴氯芬人工抗原，其合成路线如图2所示。称取5 mg巴氯芬溶于1 mL双蒸水中(用1 mol/mL的HCl调pH值为4.0左右)，加入5.4 mg NHS和9.0 mg EDC，室温避光反应30 min。称取7.8 mg BSA溶于1 mL的PBS缓冲液中，将上述巴氯芬溶液缓慢滴加其中，室温避光反应5 h。最后，将反应液转移至洁净透析袋中，4 ℃条件下用PBS缓冲液搅拌透析3 d，每天换液3次。透析结束后，5 000 r/min离心5 min去除沉淀得到巴氯芬免疫抗原(BA-BSA)。采取同样的方法制备巴氯芬包被抗原(BA-OVA)。

图2 巴氯芬免疫抗原(BA-BSA)的合成路线Fig.2 Synthetic route of baclofen immunogen (BA-BSA)

1.3 BA-BSA的鉴定

1.3.1 紫外扫描鉴定 用PBS缓冲液配制与BA-BSA质量浓度(2.1 mg/mL)一致的巴氯芬标准品溶液(BA)和BSA溶液，利用紫外-可见分光光度计在220～350 nm波长范围内分别对BA-BSA、BA、BSA进行扫描，并根据各溶液特征峰的变化判断巴氯芬与BSA的偶联效果。BA-OVA紫外扫描鉴定方法同BA-BSA。

1.3.2 SDS-PAGE鉴定 参照文献[18]配制12%的分离胶和5%的浓缩胶,备用。将10 μL BA-BSA、BSA液(BA-BSA、BSA含量均为5 μg)加入上样孔中进行电泳，电泳时浓缩胶层电压调至60 V，分离胶层电压调至90 V。凝胶电泳结束后用考马斯亮蓝染色液对分离胶染色2 h，然后用乙酸脱色液脱色6 h，通过凝胶成像系统拍照，对比BSA与BA-BSA电泳条带的位置差异，判断BA与BSA的偶联效果。

1.4 巴氯芬多克隆抗体的制备

选择4只健康的6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，将BA-BSA采用背部多点皮下注射方式免疫小鼠4次，每次间隔3周，注射量为200 μL,免疫剂量为30 μg/只。首次免疫用灭菌的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)稀释BA-BSA，并与等体积的FCA混合，充分乳化后注射小鼠。后3次免疫为加强免疫，操作与首次免疫基本相同，仅需将FCA换为FIA。免疫完成后30 d断尾采血，用PBS稀释后5 000 r/min离心5 min，取上清用于多克隆抗体的免疫学特性鉴定。

1.5 巴氯芬多克隆抗体的效价测定

用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(CBS)将巴氯芬包被抗原BA-OVA稀释为2 μg/mL，加入96孔ELISA板，每孔50 μL，4 ℃包被过夜；用含体积分数0.05% Tween 20的PBS(PBST)洗板后，每孔加入100 μL含50 g/L脱脂奶粉的封闭液PBST，37 ℃封闭1 h后洗板晾干备用。

取已包被BA-OVA的ELISA板，采用间接ELISA法测定巴氯芬多克隆抗体效价[19]。首先加入倍比稀释(1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800，1∶25 600)的多克隆抗体(50 μL/孔)于ELISA板孔中，并设置空白对照孔(加入PBS 50 μL)，37 ℃孵育15 min后洗板；然后取GaMIgG-HRP，用封闭液稀释5 000倍，加入ELISA板(50 μL/孔)，37 ℃孵育30 min后洗板；最后加入TMB显色液(50 μL/孔)显色10 min后，加入终止液(2 mol/L的H2SO4溶液)50 μL/孔，用酶标仪在450 nm处测各孔的吸光值(OD450)。判定效价的试验孔OD450值应大于等于空白对照孔OD450值的2.1倍。

1.6 巴氯芬多克隆抗体的敏感性鉴定

采用间接竞争ELISA鉴定巴氯芬多克隆抗体的敏感性[20]。取已包被BA-OVA的ELISA板，加入不同质量浓度(500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95和0 ng/mL)的巴氯芬标准溶液50 μL/孔，再加入效价测定时OD450值为1.0左右所对应稀释度的多克隆抗体50 μL/孔，并设置空白对照孔(加入PBS 50 μL，不加多克隆抗体)，37 ℃孵育15 min后洗板，其余操作步骤与多克隆抗体效价测定试验相同。测定不同质量浓度BA标准溶液孔的OD450值(B)以及0 ng/mL标准溶液孔的OD450值(B0)，以BA标准溶液质量浓度的常用对数值为横坐标、B/B0为纵坐标，绘制抑制曲线，求线性回归方程。通过线性回归方程计算半数抑制浓度(IC50)，即B/B0为0.5时所对应的标准溶液质量浓度，IC50值越低，则多克隆抗体敏感性越强。

1.7 巴氯芬多克隆抗体的特异性鉴定

通过交叉反应试验鉴定多克隆抗体特异性[21]。选择γ-氨基丁酸以及氯丙那林、可乐定、赛庚啶等瘦肉精类药物作为竞争物，通过间接竞争ELISA测定各竞争物对多克隆抗体的IC50，将巴氯芬的IC50与竞争物的IC50百分比作为交叉反应率(cross reactivity，CR)，衡量多克隆抗体特异性。

2 结果与分析

2.1 BA-BSA的鉴定

2.1.1 紫外扫描结果 人工抗原紫外扫描结果如图3所示。由图3可知，载体蛋白BSA和OVA的特征吸收峰出现在280 nm处，巴氯芬的特征吸收峰出现在约265 nm处；人工抗原BA-BSA和BA-OVA在约275 nm处出现特征吸收峰，相比BSA、OVA和巴氯芬发生明显偏移，表明巴氯芬与载体蛋白BSA和OVA偶联成功。

图3 BA-BSA的紫外扫描鉴定Fig.3 Identification of BA-BSA by UV scanning

2.1.2 SDS-PAGE结果 由图4可知，BA-BSA电泳条带的迁移速率小于BSA，说明合成的人工抗原分子质量大于载体蛋白分子质量，进一步表明巴氯芬与蛋白载体偶联成功。

2.2 巴氯芬多克隆抗体的效价

由表1可知，4只小鼠多克隆抗体效价均达到1∶25 600，说明BA-BSA具有良好的免疫原性。

表1 巴氯芬多克隆抗体效价测定结果Table 1 Titer determination of baclofen polyclonal antibody

2.3 巴氯芬多克隆抗体的敏感性

由表2可知，巴氯芬对4只小鼠多克隆抗体与包被抗原的结合均产生了抑制效果，表明多克隆抗体对巴氯芬具有一定的敏感性，其中3号小鼠多克隆抗体的敏感性最好。图5为3号小鼠多克隆抗体抑制曲线，线性回归方程为y=-0.279 7x+0.877 3，R2为0.993 6。根据方程计算IC50为 22.33 ng/mL，表明所制备的巴氯芬多克隆抗体敏感性良好。

图5 3号小鼠多克隆抗体抑制曲线Fig.5 Inhibitive curve of No.3 murine polyclonal antibody

表2 巴氯芬多克隆抗体敏感性的间接竞争ELISA鉴定结果Table 2 Sensitivity identification of baclofen polyclonal antibody by indirect competitive ELISA

2.4 巴氯芬多克隆抗体的特异性

巴氯芬多克隆抗体与γ-氨基丁酸、氯丙那林、可乐定等竞争物的交叉反应试验结果如表3所示。由表3可知，巴氯芬多克隆抗体与γ-氨基丁酸及其他6种瘦肉精类药物的交叉反应率均小于0.3%，表明所制备的巴氯芬多克隆抗体具有较强的特异性。

表3 巴氯芬多克隆抗体与竞争物的交叉反应率Table 3 Cross reactivity of baclofen polyclonal antibody with competitors

3 讨 论

饲料中一些物质的非法添加以及动物性食品中的兽药残留是养殖安全与食品安全的重要威胁，尤其是一些新型违禁添加物或替代物的出现，给动物性食品安全监控监管工作带来了新的挑战[22]。液相色谱等传统仪器检测方法在监控工作中发挥了重要作用，但随着国家及地方监管部门抽检力度的加大，急需建立快速检测方法，以与传统确证方法进行互补，提高监控效率。

以ELISA、ICA为代表的免疫学检测方法具有灵敏、特异、便捷等优势，在实际抽检工作中能够起到高效筛查的作用[23]。但免疫学快速检测方法在实际应用过程中会出现假阴性与假阳性等现象，因此必须依靠高亲和力的特异性抗体对检测方法进行优化和完善。本试验的研究对象巴氯芬属于小分子半抗原，本身不具有免疫原性，需偶联到载体蛋白上才可刺激机体免疫应答产生相应抗体[24]，而直接影响抗体特异性的半抗原分子结构设计以及人工抗原合成是获得免疫学特性良好的抗体的关键[25]。巴氯芬的分子含有羧基和氨基，为避免偶联产生间隔臂，造成“臂抗体”出现，本试验采用EDC法通过羧基将巴氯芬与载体蛋白偶联，合成人工抗原，利用紫外扫描对人工抗原偶联效果进行鉴定，并利用可判断分子质量大小的SDS-PAGE进一步鉴定人工抗原偶联效果，结果表明人工抗原的偶联效果良好，为获得免疫学特性良好的抗体奠定了基础。

用制备的人工抗原免疫小鼠制备多克隆抗体，效价达到1∶25 600，且多克隆抗体具有敏感性，其中3号小鼠多克隆抗体敏感性最好(IC50为22.33 ng/mL)，进一步表明所制备的人工抗原产生了良好的免疫效果。抗体特异性常以交叉反应率进行评价，交叉反应率越小，则特异性越强[26]，本试验采用间接竞争ELISA测定了多克隆抗体与其结构类似物γ-氨基丁酸以及氯丙那林等瘦肉精类违禁添加物的交叉反应率，结果表明多克隆抗体特异性良好，与竞争物的交叉反应可忽略，用于建立免疫学检测方法可有效排除其他药物干扰，提高检测结果的准确度。

综上所述，本试验制备了效价高、敏感性和特异性良好的巴氯芬多克隆抗体，为巴氯芬免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。