生长素调控因子OsGRF4协同调控水稻粒形和稻瘟病抗性

曹煜东 肖湘谊 叶乃忠 丁晓雯 易晓璇 刘金灵 肖应辉

生长素调控因子OsGRF4协同调控水稻粒形和稻瘟病抗性

曹煜东 肖湘谊 叶乃忠 丁晓雯 易晓璇 刘金灵*肖应辉*

(湖南农业大学 农学院/水稻油菜抗病育种湖南省重点实验室, 长沙 410128;*通信联系人, E-mail: liujinling@hunau.edu.cn, xiaoyh@hunau.edu.cn)

【】水稻粒形为多基因控制的复杂数量性状，同时影响稻谷产量和稻米外观及碾磨品质，挖掘粒形相关基因并解析其遗传机制，对于水稻高产和优质品种选育具有重要意义。以前期利用大粒籼稻品种特大籼(TDX)为供体亲本、小粒粳稻品种日本晴(Nipponbare，NPB)为轮回亲本获得的一个大粒近等基因系，在水稻第2染色体上初定位粒形调控基因()的基础上，对基因进行了精细定位和候选功能基因的克隆鉴定。利用BC4F2群体中2887份极小粒单株及该群体中70份基因型杂合的大粒单株自交获得的BC4F3群体，将基因精细定位在2M-7-1与2M-9之间的160.6 kb的区间内。该区间编码18个基因开放阅读框(-)。测序发现基因在大粒近等基因系与小粒日本晴等位基因间存在5个SNP差异，编码生长素调控因子蛋白OsGRF4。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对大粒近等基因系中ORF18进行敲除，发现敲除株系粒长变短，证实是的功能基因。进一步对ORF18大粒近等基因系和基因编辑敲除株系进行稻瘟菌室内离体和病圃接种鉴定，发现ORF18大粒近等基因系稻瘟病抗性增强，而基因编辑敲除株系稻瘟病抗性减弱，表明ORF18正调控水稻稻瘟病抗性。本研究发现的生长素调控因子OsGRF4协同调控水稻粒形和稻瘟病抗性，为协调水稻高产和抗性育种提供了重要的基因资源。

水稻；粒形性状；；；稻瘟病抗性

水稻产量由单位面积有效穗数、每穗实粒数以及粒重三个因素决定，其中粒重受粒形和充实度等因素影响。粒形属于多基因控制的数量性状，同时影响稻谷产量和稻米品质[1]。目前已定位了600多个粒形相关的QTL，包含粒长QTL 136个，粒宽QTL 139个，长宽比QTL 220个，粒厚QTL 53个和粒重性状QTL 220个[2]。在水稻第2、3和5染色体上粒形QTL分布较多，形成了多个粒形基因的热点区域。目前至少已克隆了93个水稻粒形相关基因[4]，这些基因大体可以分为3类。第1类表型是籽粒变短，植株变矮和叶倾角变小，如、和等。第2类基因主要在穗部表达，如、、等。第3类基因主要分布于粳稻，如、、等[5]，往往表现为小而圆的粒形和植株变矮。现有研究表明，水稻粒形的调控受植物激素、泛素-蛋白酶体、MAPK信号、G蛋白信号及表观修饰等多个信号通路调控，但是这些信号通路之间的交互关系尚不明确[2-5]。

生长调节因子家族是植物特有的转录因子，参与植物叶片、根系、茎和花器的生长发育进程，也参与植物对非生物胁迫以及生物胁迫的响应与调节[6-7]。目前共发现12个基因，分别被命名为。有研究发现在拟南芥中miR396通过调控其靶基因，从而调控拟南芥的胚性反应[8]，此外miR396通过调节/复合体调控拟南芥心皮数量和雌蕊发育[9]。被证明通过调节赤霉素促进水稻茎的伸长[10]。Chandran等[11]研究表明过表达、、和的转基因植株对稻瘟病菌的抗性增强，而miR396通过抑制多个负向调控水稻稻瘟病抗性。Dai等[12]发现过表达增强水稻对飞虱的抗性，揭示了---黄酮途径介导的褐飞虱抗性新机制。研究揭示在正向调控水稻粒形和穗长中发挥重要作用[13-14]。Li等[14]发现受microRNA的调控，并通过调控下游生长素因子调节水稻籽粒大小。研究发现能够与水稻生长抑制因子DELLA蛋白SLR互作拮抗，协同调控水稻氮和碳的吸收，-拮抗调节GA介导的细胞增殖，整合生长和碳氮代谢，促进水稻氮素的高效利用[15]。此外，还参与了苗期耐冷性调控[16]，表明是一个水稻生长发育和耐逆调控的重要调控因子。

笔者前期利用粳稻品种日本晴为轮回亲本、大粒籼稻品种为供体亲本连续回交并自交获得的一个BC3F4大粒近等基因系，再与日本晴回交并自交形成的BC4F2群体为材料，采用分离群体分组混合分析法在第2染色体上定位了控制水稻粒长的基因[17]()。本研究利用BC4F2群体将基因定位到160.6 kb的区间，基因注释与测序分析获得的候选基因，编码生长素调节因子，功能互补鉴定确认了就是的功能基因。通过稻瘟病抗性鉴定，发现显著增加水稻在室内和田间的抗病性，表明协同调控水稻产量性状和抗病性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以大粒籼稻品种特大籼为供体亲本，小粒粳稻日本晴为轮回亲本，经回交和自交获得了BC4F2群体，其中部分重组单株加代形成BC4F3群体。BC4F2和BC4F3群体用于粒形基因定位。BC3F4自交形成的BC3F5大粒近等基因系用于粒形性状鉴定。

1.2 DNA提取与PCR扩增

对受体、供体亲本及各组合的杂交、回交后代单株，各取约0.2 g 新鲜叶片置于2.0 μL 离心管中，液氮研磨，采用CTAB法[18]提取总DNA。

10 μL PCR体系包含10×缓冲液1.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，2 pmol/μL引物1 μL，5 U/μL酶0.1 μL，DNA模板(10 ng/μL) 1.0 μL，ddH2O 6.7 μL。采用ABI PCR系统2700型PCR仪进行DNA扩增，具体程序如下：95℃下预变性5 min，95℃下变性30 s，55℃下退火1 min，72℃下延伸30 s，35次循环；72℃下延伸7 min；16℃下保存。

1.3 基因精细定位与候选基因预测

利用连锁标记RM6424、RM318、RM13893和RM13896，对BC4F2群体中2887个小粒单株中的115个重组子进行基因型鉴定，对基因进行精细定位。利用隐性群体分析法(RCA)进行遗传图谱的构建，标记重组率计算公式为=(1+2/2)/，其中1为各标记带有大粒亲本纯合基因型的个体数，2为带有双亲杂合基因型的个体数，为小粒群体的总株数。各标记与基因间的遗传距离按每1%的重组率折合1 cM的图距计算。最后根据各标记间的遗传距离绘制基因的遗传连锁图谱。

利用遗传图谱构建中连锁标记信息，在水稻日本晴参考基因组IRGSP 1.0版本数据库中进行BLAST比对，确定各连锁标记在参考基因组上的物理位置，然后根据各标记的物理位置绘制的物理图谱。并查找各标记所在BAC克隆，构建位点的BAC克隆重叠群。

以日本晴参考基因组IRGSP 1.0为基础，对精细定位区间的基因进行功能注释，预测候选基因，对大粒近等基因系和日本晴中候选基因进行测序，选取有序列差异的基因进行转基因功能互补验证。

1.4 RNA提取与反转录

取水稻样本新鲜叶片各0.5 g，液氮速冻，充分磨碎后，使用Promega公司的Eastep Super总RNA提取试剂盒提取总RNA，提取方法参照公司提供的操作程序。经脱氧核糖核酸酶I消化DNA后，取1 μg提取的RNA使用Promega公司GoScript™ Reverse Transcription System试剂盒逆转录获得cDNA，−20℃保存用于基因克隆和表达分析。

1.5 载体构建与水稻遗传转化

基因编辑载体采用pYLCRISPR/Cas9-MTmono植物双元表达载体为基本载体，载体构建参照张会军[19]方法。首先利用CRISPR-P 2.0在线工具(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计候选基因的CRISPR/Cas9基因编辑的gRNA靶点，然后根据靶点序列设计引物（表1）。将引物稀释后等量混合，经变性退火形成具有黏性末端接头的双链DNA靶点序列片段，利用T4连接酶Ⅰ切割线性化pYL-U6a-gRNA中间载体；经两轮PCR扩增获得含Ⅰ黏性末端的U6a-gRNA片段，最后利用T4连接酶将U6a-gRNA片段连进Ⅰ酶切线性化pYLCRISPR/Cas9-MTmono植物双元表达载体，经重组质粒转化大肠杆菌DH5α；提取阳性克隆质粒，经质粒PCR和酶切鉴定后，将阳性质粒送测序公司测序，确认序列正确后，用于水稻遗传转化，构建转基因水稻。水稻遗传转化参照王文文等[20]方法，采用农杆菌介导的愈伤侵染转化法。

1.6 转基因水稻基因型鉴定

跨gRNA靶点序列前后200 bp设计引物，以转基因水稻叶片基因组DNA为模板进行PCR扩增，产物测序后与参考序列进行比对，确定其编辑序列突变类型。过表达转基因水稻基因型鉴定采用实时荧光定量PCR法，分析过表达转基因株系目的基因的表达量，表达量上升的为过表达转基因株系。

1.7 水稻籽粒形态和农艺性状测定

将成熟期的水稻材料全株取回室内调查农艺性状。株高为地面到最长穗的长度。穗长为穗颈节至穗尖的长度。分蘖数取全株分蘖总数。每株取5穗进行总粒数、实粒数以及结实率的调查。T1代植株每个株系取3株阳性植株进行农艺性状调查。收获成熟期水稻籽粒，经自然晾干后，每株取30粒，用电子游标卡尺测量粒长、粒宽、粒厚，取平均值。

结果如图5所示，Rh2-S诱导K562和KG1a细胞24 h后，与对照组比较，HDAC6和HSP90蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），α-tubulin蛋白表达水平没有变化，但是Ac-α-tubulin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。

1.8 稻瘟菌接种与菌丝生物量分析

稻瘟菌接种分别采用室内离体接种和田间病圃接种。离体接种先将浸种催芽后的种子播种于含营养土的营养钵中，置于光照培养箱生长。生长条件设置为温度28℃，光照强度20 000 Lx，12 h光照/12 h黑暗，相对湿度70%。当水稻幼苗长至3～4叶期时，剪取水稻苗第3叶，平铺于垫有湿润滤纸的方形培养皿中，用手动压环器，轻轻在叶片上压取伤环，伤环间隔2 cm。同时，将培养好的稻瘟菌菌株RO1-1的孢子用0.02%的吐温水溶液配制浓度约1×105个/mL的单个稻瘟菌分生孢子悬浮液，从中取5 μL菌液滴于水稻叶片伤环处。将培养皿盖好保湿，放于26℃生长箱黑暗处理24 h，而后置于温度26 ℃、光照和黑暗各12 h、相对湿度80%的条件下培养，7 d后调查病斑大小和面积。病斑面积测定参照崔华威等[21]的方法，将拍摄接种叶片照片导入Photoshop图像处理软件中，利用套索工具套取病斑大小，在直方图中提取单个病斑所包含的像素数，在图像栏的图像大小中可获取照片分辨率，计算病斑相对面积=/2，取平均值为各品种接种病斑面积测定值。

田间病圃稻瘟病抗性鉴定在湖南大围山病圃（东经114°5′、北纬28°30′、海拔400 m）进行，于2019年5月15日将鉴定品种（日本晴和大粒近等基因系）和诱发品种CO39催芽后播种于病圃育苗，正常水肥管理。6月19日进行田间发病调查，参照国际水稻研究所标准[22]调查发病情况，每个品种随机调查10株，统计叶瘟发病等级。

表1 CRISPR/Cas9载体构建和基因敲除植株鉴定所用引物

从各品种3片发病叶片中提取等质量叶片提取DNA，以水稻(LOC4332169)作为内参基因(UBQQ-F: CGCAAGAAGAAGTGTGGTCA；UBQQ-R: GGGAGATAACAACGGAAGCA)。利用稻瘟菌转座子Pot2的定量引物（MoPot2-F：ACGA CCCGTCTTTACTTATTTGG；MoPot2-R：AAG TAGCGTTGGTTTTGTTGGAT）进行实时荧光定量PCR检测，以水稻基因作为内参，采用相对定量法，计算各品种侵染稻瘟菌菌丝相对含量。

2 结果与分析

2.1 GS2.2的精细定位与候选基因鉴定

利用连锁标记RM6424、RM318、RM13893和RM13896，对BC4F2群体中2887份极小粒单株进行基因型分析，检测到最近连锁标记的重组子115株。在此基础上，利用已测序全基因组的水稻品种9311和日本晴之间的InDel差异，在定位区间内设计了46对InDel标记引物，筛选到29对在亲本间表现出多态性的标记。利用InDel标记分析上述115份重组子的基因型，结果显示标记2M-9出现的重组子为2个，往染色体末端方向的标记2M-24、2M-10、2M-11、2M-12、2M-15重组子分别为2、8、17、31、83个，往着丝粒方向的标记2M-22、2M-21-2、2M-21、2M-20、2M-6、2M-5、2M-4、2M-3、2M-2、2M-1均未发现重组单株（图1-A）。进而又设计了2M-001～2M-015共15对引物，发现2M-001、2M-002、2M-005、2M-006、2M-008、2M-012、2M-015鉴定到重组子分别为1、1、2、2、2、2个。由此，将目标基因界定在标记2M-001～2M-9之间。

该染色体区间的物理距离约为952.7 kb，为了进一步缩小定位区间，选择了BC4F3群体中的70份大粒表型的植株（L1-L70）和70份小粒表型植株(S1-S70)作为定位材料，运用迭代法来推测基因所在区间。结果表明，在S1-S70小粒群体中发生交换的植株即重组子，在标记2M-3、2M-1、2M-001、2M-006、2M-008处重组子数目分别为3、4、4、4、6。通过小粒植株S11和S9，大粒植株L12、L22、L37的基因型迭代法分析，将基因定位在2M-7-1与2M-9之间160.6 kb区间内（图1-B～C）。

A−GS2.2精细定位遗传图谱；B−GS2.2位点BAC克隆重叠群和物理图谱；C−重组株系迭代法确定GS2.2物理区间，其中NIL为大粒近等基因系，NPB为日本晴，“L+数字”代表表型为大粒的重组株系，“S+数字”代表表型为小粒的重组株系，右侧为对应株系粒长和粒宽。

Fig. 1. Construction of genetic map and physical map of.

利用RGP在线基因预测软件RiceGAAS (http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)，结合在线数据GRAMENE、TIGR、NCBI的基因注释，对精细定位160.6 kb区间进行基因预测得到18个ORF，其中ORF18是已经被克隆的粒形基因，其编码生长调控因子，正调控粒长，推断可能是或其等位基因（表2）。

表2 GS2.2候选基因预测分析

进一步对日本晴和大粒近等基因系中的等位基因进行测序分析，发现大粒近等基因系中等位基因与日本晴中小粒等位基因在编码区存在5个SNP的变异，分别位于第1、2和3外显子，其中第1外显子存在1个SNP变异，没有导致氨基酸变异；第2、3外显子各存在2个SNP变异，均导致了氨基酸的变异（图2）。

2.2 基因编辑转基因水稻基因型鉴定

图2 NIL和日本晴等位基因的OsGRF4基因结构和自然变异

Fig. 2.structure and natural variation in alleles from NIL and NPB.

A―OsGRF4基因编辑靶点序列；B―OsGRF4基因编辑株系敲除系靶点突变基因型。

Fig. 3. Sequence of target site for OsGRF4 CRISPR / Cas9 gene editing and genotype of OsGRF4 CRISPR / Cas9 gene editing lines in NIL background.

表3 OsGRF4 CRISPR/Cas9基因编辑敲除突变类型

2.3 转基因水稻粒形和农艺性状表型分析

与转化受体-NIL相比，CR-NIL-20、CR-NIL-23突变体(图中分别简写为CR20、CR23)的T1代纯合株系的籽粒长度、厚度和千粒重极显著减小（图4-A～B），粒长分别减小16.57%和23.27%(图4-C)，粒厚分别减小2.94%和7.14%（图4-E），千粒重分别下降30.39%和32.82%（图4-F）。CR-NIL-20的粒长、粒宽、粒厚与日本晴相比差异均不显著（图4-C～E）；而CR-NIL-23的粒长和粒厚均较日本晴显著变小，分别减小5.72%和5.15%（图4-A、C、E）。两个编辑株系相比日本晴千粒重降低了16.94%～19.83%，均达到极显著差异(图4-F)。结果表明，就是的功能基因。

对其他农艺性状调查结果表明，与-NIL相比，基因编辑株系的株高、穗长极显著降低（图5-A～C），而每穗粒数极显著增加（图5-E），但是分蘖数无显著差异(图5-D)。日本晴和基因编辑株系CR-NIL-23的每穗实粒数和结实率显著高于-NIL，但基因编辑株系CR-NIL-20则显著降低（图5-F、G）。结果显示，对水稻株高、穗长和穗粒数也有重要调控作用。

2.4 稻瘟病抗性表型鉴定

田间病圃的稻瘟菌抗性鉴定结果显示感病对照品种CO39的发病等级为8.7级，日本晴的发病等级为6.1级，而-NIL的发病等级为3.6级，表明-NIL株系在田间的抗性显著强于日本晴（图6-A～B）。

A和B―GS2.2-NIL背景下OsGRF4基因编辑转基因株系粒长和粒宽；C～F―GS2.2-NIL背景下OsGRF4基因编辑转基因株系粒长、粒宽、粒厚和千粒重统计。*P<0.05; **P<0.01(t测验)。误差线表示SD (n=30)。NIL―GS2.2-NIL; CR20−CR-NIL-20; CR23−CR-NIL-23.

Fig. 4. Grain shape of gene editing lines in-NIL background.

A―NIL背景下基因编辑株系株型；B～G, NIL背景下基因编辑株系株高、穗长、分蘖数、每穗总粒数、每穗实粒数和结实率。显著性分析采用测验，图中误差值以表示（=3）。NIL―-NIL; CR20−CR-NIL-20; CR23−CR-NIL-23.

A, Plant architecture for gene editing lines. B-G, Plant height, panicle length, tiller number, total grains per panicle, number of full grains per panicle and seed setting rate for gene editing lines. The-test was used for significance analysis. Error bar indicated thevalue (=3).**<0.01.

NIL,-NIL; CR20, CR-NIL-20; CR23, CR-NIL-23.

图5 NIL背景下基因编辑株系农艺性状表型

Fig. 5. Phenotype of agronomic traits ofgene editing lines in NIL background.

A―叶片病圃发病症状；B―叶片病圃发病级别统计。显著性分析采用t测验，图中误差值以SD表示(n=10)。**P<0.01(t测验)。

Fig. 6. Symptoms of-NIL and Nipponbare(NPB) after infected by rice blast fungal in natural disease nurse.

进一步对-NIL和日本晴进行稻瘟菌室内离体接种鉴定(图7-A)，发现-NIL的稻瘟菌侵染病斑面积和菌丝相对生物量均显著低于日本晴(图7-B～C)，表明-NIL近等基因系的稻瘟病抗性显著增强。

进一步对基因编辑株系进行室内离体接种，发现其病斑面积、菌丝相对生物量比-NIL均显著增加（图8），表明功能缺失导致水稻植株稻瘟菌抗性降低。综上表明，可正向调控水稻对稻瘟菌的抗性，且具有著的增强田间抗性作用，具有重要的育种利用价值。

A―病斑症状；B―病斑相对菌丝量生物量；C―病斑相对面积。显著性分析采用t测验，图中误差值示SD(n=3)。**P<0.01(t测验)。

Fig. 7. Symptoms of-NIL and Nipponbare(NPB) afterinoculation withrice blast fungus.

3 讨论

挖掘水稻粒形调控基因，解析粒形的分子遗传基础，对利用分子育种技术精准培育优质高产的水稻品种有着重要的理论意义。目前国内外已有近100个水稻粒形的基因被克隆[3]，极大地丰富了对水稻籽粒形态形成的遗传基础的认知。本研究通过图位克隆，从籼稻品种中鉴定到了一个控制水稻粒形的基因，基因克隆与验证表明，基因编码生长调控因子。已有研究表明，水稻生长调控因子基因家族基因对水稻生长发育、产量形成和氮素利用起着重要调控作用。最近，几个研究小组通过利用不同材料的研究也证明了参与水稻粒形的调控[13-14]。此外，最近报道表明，还能够促进NH4+的吸收从而促进水稻植株生长，敲除株系由于NH4+吸收降低导致株高变矮，而氮肥可以通过影响叶绿素的合成从而间接影响植物的光合作用和产量[23-24]。本研究中也发现敲除显性基因同时导致水稻粒形显著变小，株高和穗长显著降低（图4、5），表明是一因多效的粒形和株型调控因子。

家族基因对水稻抗病性调控也起着重要的作用，过表达、、和的转基因植株对稻瘟病菌的抗性增强，miR396通过抑制多个来负向调控水稻抗稻瘟病[11]。本研究发现显著增强了水稻对稻瘟菌的抗性，且在室内接种和室外病圃鉴定均表现出较强的抗性，具有重要的育种利用价值。

A―病斑表型；B―病斑面积；C―病斑相对菌丝量生物量。显著性分析采用t测验, 图中误差线示SD（n=3）。*P<0.05; **P<0.01. NIL-15, CR-NIL-15.

Fig. 8. Symptoms of-NIL, Nipponbare(NPB) and CRISPR/Cas9 editing lines afterinoculationwithrice blast fungus.

高产和抗病性是水稻育种的两个重要目标，一般认为抗性增强往往会导致水稻产量受损。但一些报道表明部分稻瘟病抗性基因对产量影响很小甚至没有影响，[25]和[26]使稻瘟病抗性和产量之间达到一种平衡，而没有显著减产。而水稻株型和产量调控因子IPA1能通过维持生长和免疫之间的平衡来提高产量和抗病性[27]。本研究发现也能协同调控水稻产量构成因子粒形与稻瘟病抗性，为水稻高产和抗病育种提供新基因和新思路。但是，协同调控水稻粒形和抗病性的分子机制尚不清楚，有待进一步深入研究。

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Auxin Regulator OsGRF4 Simultaneously Regulates Rice Grain Shape and Blast Resistance

CAO Yudong, XIAO Xiangyi, YE Naizhong, DING Xiaowen, YI Xiaoxuan, LIU Jinling*, XIAO Yinghui*

(Agronomy College, Hunan Provincial Key Laboratory of Rice and Rapeseed Breeding for Disease Resistance, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;*Corresponding author, E-mail: liujinling@hunau.edu.cn , xiaoyh@hunau.edu.cn)

【】Rice grain shape is a complex quantitative trait controlled by multiple genes, which affects rice yield, rice appearance and milling quality simultaneously. It is of great significance to explore the genes related to grain shape and elucidate its genetic basis. Previously, a gene, namely, which controls rice grain size, was mapped on the chromosome 2, by using a set of near isogenic lines derived from the small-grainrice variety Nipponbare (NPB) as the recurrent parent, and anrice variety Tedaxian(TDX) as the donor parent.】In this study, fine mapping ofand identification of candidate functional genes were carried out.【】was fine mapped to the 160.6 kb interval between the makers of 2M-7-1 and 2M-9, by using a BC4F2population with 2887 small grain size plants and a BC4F3population with 70 large grain size plants. Bioinformatics analysis showed that the 160.6 kb chromosome interval encodes 18 open reading frames (termed as ORF1-18, respectively). Sequence analysis showed that there were five SNP differences in ORF18 between the large grain near isogenic line and Nipponbare. ORF18 encoded an auxin regulatory factor protein OsGRF4. The grain length of ORF18 knockout lines, whose ORF18 was knocked out in large grain near isogenic lines by using CRISPR/CAS9 gene editing technology, became smaller. The above results confirmed thatwas a functional gene of. Further identification of ORF18 near isogenic lines (ORF18-NIL) and gene editing knockout lines byinoculation and disease nursery inoculation showed that the rice blast resistance of ORF18-NIL increased, while that of gene editing knockout lines decreased, indicating that ORF18 also positively regulates rice blast resistance. 【】The auxin regulatorfound in this study simultaneously regulates rice grain shape and blast resistance, which provides an important gene for breeding rice variety with high yield in coordination with enhanced resistance.

rice; grain shape;;; rice blast disease resistance

10.16819/j.1001-7216.2021.210206

2021-02-19;

2021-03-16。

国家重点研发计划资助项目(2016YFD0101100)。