良恶性肾上腺嗜铬细胞瘤VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR表达差异及与患者预后的关系

吕苏一 张磊 李山成

肾上腺嗜铬细胞瘤（Pheochromocytoma，PCC）是肾上腺较为常见肿瘤，由于其良、恶性具有相似临床表现、组织学形态及超微结构，故鉴别难度较大，严重影响临床制定针对性治疗方案及预后改善［1⁃3］。因此，准确鉴别肾上腺PCC 性质是目前临床亟需解决的问题。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最为强烈的血管通透性因子，可诱导新生血管生成，参与肾细胞癌［4］、宫颈癌［5］等多种恶性肿瘤病理进程。黑色素A（melanA）是恶性黑色素瘤特异性免疫指标，在肾细胞癌中呈低表达。另有研究表明［6］，长链非编码RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）在肿瘤细胞增殖、迁移、凋亡和自噬调控中亦起着重要作用。HOX 基因的反义基因间RNA（HOX transcript anti⁃sense intergenic RNA，HOTAIR）是第一个临床发现的lncRNA，具有反式转录调控基因表达作用，在肝癌［7］、胃癌［8］等增殖、浸润及转移中的作用已被临床证实。本研究尝试探讨良恶性PCC 患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表达差异及对患者预后的影响，旨在为临床诊治、预后评估提供潜在途径。报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2017年2月至2020年2月肥城查庄矿医院肾内科收治的69 例恶性PCC 为恶性组，33 例良性PCC 为良性组，采集手术切除的良恶性PCC 组织标本。其中恶性组男42 例，女27 例，平均年龄（43.82±3.04）岁；良性组男20 例，女13 例，平均年龄（44.19±2.85）岁。纳入标准：①两组均经手术病理组织学确诊；②所有研究对象均签署知情同意书；排除标准：①术前有放化疗、激素治疗史者；②合并心脑等其他重要脏器器质性损害者；③合并自身免疫系统疾病或全身感染性疾病者；④合并其他部位恶性肿瘤者；⑤语言与听力功能障碍或精神行为异常者。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

采集手术切除的良恶性PCC 组织标本（3 cm×3 cm）：①使用中性福尔马林（4%）固定，石蜡包埋，连续切片，首先采用抗体染，出现棕色，后用苏木素染核染蓝色。采用免疫组织化学法试剂盒检测VEGF、melanA 表达。结果判定［9］：每张切片均由具备丰富经验的2 名病理医师根据染色范围与染色强度评分进行判断，VEGF、melanA 阳性均以高倍显微镜下细胞质或细胞膜产生棕黄色或棕褐色颗粒沉着为准，其中染色范围分为1 分、2 分、3 分、4 分；染色强度分为0 分（与背景接近）、1 分（稍微高于背景色）、2 分（显著超过背景色）、3 分（出现深棕黄色）。染色范围、染色强度评分结果相加，0～3 分为阴性，>3 分为阳性。②采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应试剂盒检测LncRNA HOTAIR 表达，根据Ct 值判定检测结果，其中Ct 值<26 为阳性，26≤Ct 值<29 为弱阳性，Ct 值≥29 为阴性。

1.2.2 治疗方法

PCC 患者行腹腔镜手术治疗，恶性患者手术切除肿瘤后4 周接受辅助治疗或化疗。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS 22.0 处理数据，计数资料用n（%）表示，行χ2检验；VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表达与恶性组病理特征的相关性分析采用Spearman 相关系数模型；VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表达对良恶性肾上腺PCC 的鉴别价值分析采用受试者工作特征（ROC）曲线；VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表达与恶性肾上腺PCC 患者1年生存率的关系采用卡普兰⁃迈耶曲线（KM）法分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组VEGF、melanA、LncRNAHOTAIR阳性表达

恶性组VEGF、LncRNA HOTAIR 阳性表达率高于良性组，melanA 阳性表达率低于良性组（P<0.05）。见表1、图1。

图1 良恶性肾上腺PCC 患者VEGF、melanA 表达（SP，×400）Figure 1 The expression of VEGF in patients with benign and malignant adrenal PCC was detected（SP，×400）

表1 两组VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 阳性率比较［n（%）］Table 1 Comparison of the positive expression of VEGF，Melania and lncrna hotair between 2 groups［n（%）］

2.2 恶性组不同临床资料患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 阳性表达比较

恶性组不同年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤体积患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 阳性表达率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；恶性组不同临床分期、分化程度、浸润程度、有无淋巴结转移患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 恶性组不同临床病理特征患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 阳性表达比较［n（%）］Table 2 Comparison of positive expression of VEGF，Melania and lncrna hotair in patients with different clinicopathological characteristics in malignant group［n（%）］

2.3 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表达与恶性组临床病理特征的相关性

经Spearman 相关性分析可知，VEGF、LncRNA HOTAIR 阳性表达与恶性组临床分期、浸润程度、淋巴结转移呈正相关，与分化程度呈负相关，melanA 阳性表达与恶性组临床分期、浸润程度、淋巴结转移呈负相关，与分化程度呈正相关（P<0.05）。见表3。

表3 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表达与恶性组临床病理特征的相关性Table 3 Correlation between expression of VEGF，Melania，lncrna hotair and clinicopathological features of malignant group

2.4 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表达对恶性肾上腺PCC 的鉴别效能

绘制ROC 曲线，结果显示，VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 联合鉴别恶性肾上腺PCC 的曲线下面积（AUC）为0.919（95%CI：0.848～0.964），敏感度、特异度分别为89.86%、93.94%（P<0.05）。见图2。

图2 ROC 曲线Figure 2 ROC curve

2.5 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表达与肾上腺PCC 患者1 生存率的关系

随访1年，恶性肾上腺PCC 患者脱落2 例。VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 阳性表达患者1年生存率低于阴性表达患者（χ2=7.655，P=0.006；χ2=5.012，P=0.025），melanA 阳性表达患者1年生存率高于阴性表达患者（χ2=4.724，P=0.030），见图3。

图3 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表达与肾上腺PCC 患者1 生存率的关系Figure 3 Relationship between VEGF，Melania，lncrna hotair expression and 1 survival rate in adrenal PCC patients

3 讨论

本研究中，恶性PCC 患者VEGF 阳性表达率高于良性PCC 患者，并与患者临床分期、浸润程度、淋巴结转移存在正相关性，与分化程度存在负相关性。VEGF 可提高微血管通透性，诱导血管内皮细胞异常增殖，加快新生血管形成，进而促进肿瘤细胞生长、浸润及转移［10］。

既往研究表明［11］，VEGF 在多种恶性肿瘤尤其是出现浸润和转移的恶性肿瘤中表达率超出80.0%。结合贺亮亮［12］研究考虑上述结果产生机制可能在于VEGF 通过结合肿瘤细胞表面受体，可活化下游信号通透，直接调控肿瘤干细胞形成、增殖等进程，同时，其通过血管通透性，可介导基质溶解、新血管网构建、管腔形成等肿瘤血管形成过程，从而参与恶性PCC 细胞增殖、浸润及转移过程。提示对存在VEGF高表达PCC 患者需警惕其存在恶性倾向可能性。

melanA 在血管周细胞瘤、多数类固醇肿瘤（包括PCC）及黑色素细胞病变中表达，吕祥瑞等［13］通过免疫组织化学法检测可知，恶性PCC 患者melanA 表达较低，并与患者临床分期、浸润程度、淋巴结转移、分化程度存在一定相关性，支持本研究观点，可见melanA 表达变化可为PCC 性质临床鉴别提供新的医学思路。推测提高melanA 表达可能是阻断PCC 恶变、浸润、转移的重要途径。

另外，本研究结果还发现，本研究提出，LncRNA HOTAIR 在恶性PCC 患者中呈高表达，且与临床分期、浸润程度、淋巴结转移、分化程度有关，与孙青风等［14］研究相似。LncRNA HOTAIR 是一种促癌基因，在多种恶性肿瘤中表达升高，具有早期鉴别肿瘤、术后监测肿瘤复发及作为特异药物治疗靶点的潜在价值［15］。这可能归因于LncRNA HOTAIR不仅可调控HOXD 启动子相关蛋白的组蛋白修饰，激活原癌基因，破坏原癌基因与抑癌基因平衡，还能靶向调控雷帕霉素靶蛋白信号通路，提高葡萄糖同型转运蛋白⁃1 表达，强化癌细胞无氧糖酵解获能能力，从而参与肿瘤细胞生长、增殖、侵袭、转移调控。说明LncRNA HOTAIR 与恶性PCC 发生、发展存在一定关系，可能作为恶性PCC 鉴别生物标志物，为后续研究及治疗提供新靶点。进一步明确证明三者联合鉴别恶性PCC 的AUC 为0.919，优于单独指标鉴别，提示三者联合有助于提高恶性PCC 鉴别效能，具有一定推广实用性。

此外，本研究通过Log⁃Rank 检验还表明，VEGF、LncRNA HOTAIR 高表达、melanA 低表达可能降低恶性PCC 患者1年生存率，这可能与VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 异常表达可能诱导肿瘤细胞异常增殖、加剧浸润深度、上调局部或远处转移风险，从而引起不良预后有关。由此可见，VEGF、LncRNA HOTAIR 表达对恶性PCC 预后亦具有一定预测价值。但本研究局限性在于纳入样本量小，未分析VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR三者之间相关性及在PCC 中的具体作用机制，今后需进一步开展大样本研究论证所得结果。

综上所述，恶性PCC 患者VEGF、LncRNA HOTAIR 表达升高，melanA 表达下降，三者联合检测可为临床鉴别PCC 性质、评估病理特征、预测预后提供循证支持。