盐酸青藤碱通过抑制bFGF介导的乳腺癌血管新生发挥抑瘤作用

张慧敏，刘晓旭，谢佩玲，陈和燕，何建军，王 珂

（西安交通大学第一附属医院乳腺外科，陕西西安 710061）

血管新生是包括乳腺癌在内的许多恶性肿瘤的特征之一[1]。与正常组织的血管不同，实体瘤的血管不仅生长活跃、结构紊乱，且大多数为无功能血管，而这种结构和功能的异常会导致瘤内缺氧，引起肿瘤生物学行为的进一步恶化。虽然基础研究结果证实血管新生对于乳腺癌的生长和转移是必须的，提示抗血管生成治疗可使患者受益，然而多项临床研究的结果却不尽如人意[2]。因此，积极探寻其他抑制血管新生的方法迫在眉睫。

青藤碱是从青藤的根茎中提取的生物碱单体，临床常用其盐酸盐（盐酸青藤碱）治疗风湿及类风湿性疾病。青藤碱的药理学作用广泛，包括抗炎、免疫调节、抗血管新生、抗心律失常以及轻微的镇静、镇痛作用。近年来的研究还发现，青藤碱对肝癌、胃癌、乳腺癌、骨肉瘤等肿瘤细胞均具有抑制增殖、阻滞细胞周期和诱导凋亡的作用[3-7]。

在类风湿性关节炎的研究中已证实，青藤碱可以通过抑制HIF-1α-VEGF-ANG-1轴发挥抗血管生成的作用[8]，而尚未见青藤碱对实体瘤血管新生的体内研究报道。本研究观察盐酸青藤碱在乳腺癌中的抗血管新生作用及其潜在的分子机制，旨在为临床抗血管新生治疗提供可能的药物选择和相关临床前证据。

1 材料与方法

1.1 细胞株和动物小鼠乳腺癌细胞4T 1由西安交通大学第一附属医院药剂科封卫毅教授惠赠，168FARN由美国贝勒医学院Jianming XU教授惠赠，6～8周龄、体质量18～20 g的BALB/c小鼠购自西安交通大学实验动物中心。于西安交通大学实验动物中心动物实验室SPF环境下进行实验和动物饲养。

1.2 细胞培养小鼠乳腺癌细胞株4T 1、168FARN培养于含100 mL/L胎牛血清、1%双抗的DMEM培养液（Hyclone，美国）中，置于含50 mL/L CO2的37℃恒温细胞培养箱内，2.5 g/L胰酶消化传代。取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 小鼠原位移植瘤模型取对数生长期4T 1细胞制备单细胞悬液，于小鼠第四乳头下脂肪垫内注射1×106个细胞，每天观察肿瘤生长情况，每2～3 d测量小鼠体质量变化以及肿瘤的长短径。细胞注射后24 h开始，每天经腹腔注射含有特定浓度盐酸青藤碱（陕西宝鸡永嘉天然植物开发有限公司）的生理盐水0.2 mL（5 mg/mL或10 mg/mL），对照组注射0.2 mL生理盐水。每组6只小鼠，共给药14 d，于第15天处死小鼠，30 min内完整切除肿瘤，称重后一半置于中性福尔马林固定液中，一半切成条状速冻于液氮中。

1.4 MTT法收集对数期4T 1细胞或168FARN细胞，制成单细胞悬液，以相同细胞数接种至96孔板内，待细胞贴壁后按照实验分组，分别给予含有不同终 浓度盐 酸 青 藤 碱（0、31.25、62.5、125、250、500、1 000μmol/L）的细胞培养基，分别培养20、44、68 h，每孔加入5 mg/mL的MTT 20μL，置于细胞培养箱继续培养4 h。小心弃去上清，每孔加入DMSO 150μL以溶解蓝紫色结晶甲臜，于摇床避光震荡混匀10 min使结晶完全溶解。用酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm波长处吸光度（A）值，根据以下公式计算细胞增殖抑制率，绘制药物的剂效曲线：各孔的增殖抑制率（growth inhibition）（%）=（1―实验组A值/对照组A值）×100%。

1.5 免疫组化染色肿瘤组织经中性福尔马林固定，石蜡包埋后切片，经脱蜡水化，修复抗原后50 g/L牛血清白蛋白封闭，滴加CD31抗体（Abcam，英国），4℃过夜，二抗孵育后DAB显色，苏木素复染。使用Olympus光学照相系统采集图像，在每张切片癌巢区域随机抓拍5张，采用Imagepro-Plus6.0显微镜图像分析软件，计算CD31阳性区域的面积（代表新生血管面积），取5张切片的平均值反映1个标本的血管新生情况。

1.6 酶联免疫吸附实验（ELISA）按文献报道制备瘤组织肿瘤细胞外液（TEF）样品[9]：瘤组织液氮速冻后，压碎成直径小于2 mm的碎片，按照质量︰体积=1︰2的比例用2×PBS重悬组织碎片，并于4℃旋转2 h，涡旋震荡后2 200g离心3 min，收集上清至新EP管即为TEF；培养细胞的裂解液制备：采用不同浓度盐酸青藤碱（0、62.5、250、1 000μmol/L）处理4T 1或168FARN细胞系24或48 h后，经胰酶消化，1 000 g离心10 min收集细胞后置于冰上，加入预冷的PBS反复洗涤3次以去除残留培养基，将清洗过的细胞重悬于PBS后进行细胞计数，调整细胞密度一致并转移相同体积至提前标记好的EP管中，然后置于−20℃过夜。经过2轮反复冻融破坏细胞膜后，于2～8℃10 000 g离心10 min，取上清立即检测。将碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）及样品置于室温复温，将准备好的标准品或样品各100μL至检测孔中，4℃孵育过夜，次日根据试剂盒说明书依次加入二抗、TMB底物和终止液，立即在酶标仪读取450 nm处A值，根据标准品及其A值绘制标准曲线，保证R2>0.98，依据标准方程计算样品中bFGF的浓度。

1.7 RT-qPCR不同浓度盐酸青藤碱（0、250、1 000μmol/L）处理4T 1或168FARN细胞系24或48 h，分别提取各组细胞总RNA，按TaKaRa逆转录试剂盒说明书将其逆转录为cDNA，进行定量PCR扩增反应，每组设定3个复孔。FGF2特异性引物为5′-CTACAACTCCAAGCAGAAGA-3′和5′-GT⁃TATTAGATTCCAGTCGTTCAA-3′。扩增条件：96℃预温5 min，随后进行96℃30 s、57℃30 s和72℃30 s的扩增，共40个循环，最后72℃延伸10 min。

1.8 在线生存分析使用Kaplan-Meier Plotter在线生存分析软件（http://kmplot.com/analysis/）[10]分析bFGF表达与乳腺癌患者生存情况的关系。该软件可以用来评估基因与肿瘤生存的关系，所采用的数据 来 源 于GEO（Gene Expression Omnibus）、EGA（European Genome-Phenome Archive）和TCGA（The Cancer Genome Atlas）三大开放数据库，其中包括了1 117例乳腺癌患者总生存（OS）、3 554例乳腺癌患者的无复发生存（RFS）和1 609例乳腺癌患者的无远处转移生存（DMFS）数据。

1.9 统计学分析运用统计学软件SPSS 17.0（Chi⁃cago，IL，USA）进行统计分析。计量数据采用均值±标准差表示，并采用Levene检验进行方差齐性检验，P>0.05表明符合方差齐性假设。实验数据两组之间的差异比较采用Student’st检验；多组之间的比较采用ANOVA检验，各组与对照组之间的比较采用Dunnett事后检验。不同盐酸青藤碱剂量和给药后时间对肿瘤细胞裂解液中bFGF浓度、mRNA表达及原位移植瘤体积的影响采用析因分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 盐酸青藤碱的体内抑瘤作用与对照组比较，100 mg/kg盐酸青藤碱组的4T 1原位移植瘤生长抑制（P<0.01），瘤重减少（P<0.05），而50 mg/kg盐酸青藤碱对肿瘤生长无明显抑制；析因分析显示，盐酸青藤碱剂量和给药时间对4T 1原位移植瘤体积有影响（P<0.001），且二者对肿瘤体积的影响有交互作用（P<0.001）；本研究所用的剂量范围和干预时间内，4T 1移植瘤模型的小鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05，图1），提示50～100 mg/kg盐酸青藤碱未产生明显系统毒性。

图1 盐酸青藤碱的体内抑瘤作用Fig.1 The inhibitory effect of SH on tumor growth in vivo

2.2 盐酸青藤碱对体内血管新生的抑制作用体外MTT实验结果显示，盐酸青藤碱在24～72 h对4T 1细胞增殖抑制作用的IC50值均大于1 000μmol/L（图2A），在24～48 h对于168FARN细胞增殖抑制作用的IC50值均大于1 000μmol/L，在72 h大于500μmol/L（图2B）。

小鼠原位移植瘤组织中内皮细胞标记分子染色显示，盐酸青藤碱干预组CD31+内皮细胞占瘤组织面积的百分比少于对照组（P<0.01，图2C、2D），提示肿瘤内新生血管面积下降，证明了盐酸青藤碱的抗血管新生作用。

图2 盐酸青藤碱对体内血管新生的抑制作用Fig.2 The anti-angiogenic effect of SH in vivo

2.3 盐酸青藤碱对bFGF的生成和分泌的影响ELISA定量检测结果显示，盐酸青藤碱组的TEF中的bFGF较对照组下降（P<0.01，图3A），提示4T 1原位移植瘤的血管新生减少与组织间液中bFGF的浓度下降有关。体外实验进一步证实，4T 1及168FARN细胞裂解液中，盐酸青藤碱组的bFGF水平下降（P<0.05，图3D、3E），提示盐酸青藤碱的抗血管新生作用与其对肿瘤细胞分泌的血管生成因子——bFGF生成的抑制作用相关。析因分析显示，盐酸青藤碱剂量对4T 1细胞裂解液中bFGF浓度有影响（P<0.001）；给药后时间对4T 1细胞裂解液中bFGF浓度无影响（P=0.104）；盐酸青藤碱剂量和给药后时间对4T 1细胞裂解液中bFGF浓度的影响无交互作用（P=0.377）。盐酸青藤碱剂量对168FARN细胞裂解液中bFGF水平有影响（P<0.001）；给药后时间对168FARN细胞裂解液中bFGF水平无影响（P=0.692）；盐酸青藤碱剂量和给药后时间对168FARN细胞裂解液中bFGF水平影响无交互作用（P=0.479）。

RT-qPCR结果显示，盐酸青藤碱组bFGF的mRNA表达也出现下降（P<0.05，图3B、3C），提示盐酸青藤碱通过抑制bFGF转录进而影响其蛋白表达。析因分析显示，盐酸青藤碱剂量及给药后时间对4T 1细胞bFGF的mRNA表达有影响（P<0.001；P=0.028）；盐酸青藤碱剂量和给药后时间对4T 1细胞bFGF mRNA表达影响无交互作用（P=0.238）。盐酸青藤碱剂量及给药后时间对168FARN细胞bFGF的mRNA表达有影响（P<0.001；P=0.011）；盐酸青藤碱剂量和给药后时间对168FARN细胞bFGF mRNA表达影响有交互作用（P=0.012）。以上结果提示，盐酸青藤碱通过抑制肿瘤细胞产生、分泌bFGF，而降低TEF中bFGF水平，进而影响对内皮细胞的作用，减少血管新生。

图3 盐酸青藤碱对bFGF生成和分泌的影响Fig.3 The inhibitory effect of SH on bFGF production and secretion

2.4 bFGF表达与乳腺癌患者预后的关系通过Kaplan-Meier Plotter在线生存分析软件对bFGF mRNA表达与乳腺癌患者预后进行相关性分析，所有随访患者按照bFGF的mRNA表达大于或小于中位值（median）分为bFGF高表达组（红色曲线）和bFGF低表达组（黑色曲线），分别选取OS、RFS和DMFS作为终点（endpoint），两组患者生存曲线分析结果显示，bFGF高表达乳腺癌患者的OS更差（HR=1.41，95%CI1.11～1.79，P<0.01，N=1 117）、RFS（HR=1.31，95%CI1.17～1.47，P<0.001，N=3 554）以及DMFS（HR=1.36，95%CI1.11～1.67，P<0.01，N=1 609，图4）。这证明bFGF mRNA高表达与乳腺癌患者较差预后相关，提示盐酸青藤碱在抑制乳腺癌细胞表达bFGF的同时，可能会延长乳腺癌移植模型动物及乳腺癌患者的生存期。

图4 bFGFmRNA表达与乳腺癌患者预后的关系Fig.4 Correlation between bFGF mRNA expression and the survival of the patients with breast cancer

3 讨 论

血管新生在乳腺癌的生长和转移中均发挥重要作用，寻找有效的抗血管新生药物是乳腺癌研究领域的热点。既往研究发现，盐酸青藤碱的抗肿瘤作用主要依赖于对肿瘤细胞增殖的直接抑制，很少关注盐酸青藤碱对于肿瘤血管的影响，而肿瘤血管在肿瘤微环境中却有非常重要的作用，微环境状态直接或间接影响着肿瘤细胞的生物学特性、增殖或转移的能力以及联合治疗的效果，以至患者的预后[11]。4T 1乳腺癌细胞系来源于BALB/c小鼠，进展迅速，易于发生肺转移，常用来模拟人的Ⅳ期乳腺癌。本研究以小鼠4T 1细胞系为研究对象，乳腺癌原位移植瘤模型研究结果显示，盐酸青藤碱可抑制4T 1乳腺癌移植瘤的生长；体外实验结果显示，盐酸青藤碱对4T 1细胞增殖抑制作用的IC50值明显高于其他已知抗肿瘤药物对乳腺癌细胞系增殖抑制作用的IC50值[12]。提示盐酸青藤碱的体内抑瘤作用的机制并非源于其对肿瘤细胞直接的毒性杀伤作用，而是通过细胞毒作用以外的药理作用抑制肿瘤的生长。进一步的研究证实盐酸青藤碱可通过抗肿瘤血管新生产生抑瘤效应，其在该4T 1乳腺癌原位移植瘤研究模型中的抗肿瘤作用主要依赖于对肿瘤间质的影响，而其对肿瘤的多个其他生物学行为的影响，尚需进一步研究。

bFGF作为已知的促血管生成效应最强的因子之一，几乎参与了血管新生的所有步骤，比如基底膜的降解，内皮细胞向间质迁移、出芽以及增殖[13]。本研究体内实验结果提示，盐酸青藤碱干预组的肿瘤组织中bFGF的水平下降了40%，同时体外细胞实验还证实了这一变化是由于盐酸青藤碱抑制肿瘤细胞内bFGF的mRNA表达。有研究报道，在角膜内皮细胞中IL-1β可诱导IκB降解，促进NF-κB的激活，而活化的NF-κB可以结合到bFGF的DNA启动子区域启动bFGF的转录，提示在这一条件下bFGF作为NF-κB的靶基因直接受其调控[14]。本课题组前期研究发现，在乳腺癌细胞系MDA-MB-231（三阴性型）中，盐酸青藤碱可以剂量依赖性地促进NF-κB和IκB的结合，抑制NF-κB的核转位，使NF-κB的靶基因胆囊收缩素（CCK）、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白介素-11（IL-11）蛋白水平下降，提示盐酸青藤碱可抑制NF-κB的活性[15]。虽然已有一些研究证实盐酸青藤碱可以抑制NF-κB的水平和活性发挥抗炎和逆转化疗耐药等作用，但其是否是通过调节NF-κB从而抑制bFGF的表达水平仍需要进一步探索。

综上所述，盐酸青藤碱可通过抑制bFGF诱导的血管新生产生抑瘤作用。而通过临床数据分析显示bFGF的高表达与乳腺癌患者生存较差相关，提示盐酸青藤碱可能通过抑制bFGF发挥抗肿瘤作用的同时，改善患者预后。而盐酸青藤碱可否作为一种新型抗肿瘤药物应用于临床仍需要更深入的临床前研究。