miR-29b-3p靶向PTEN在先天性心脏病中的作用及其机制

刘 萍，杨麦巧，杨也天，王一婷，刘丽丽，马元平，王 芳，何 川

（1.昆明医科大学附属延安医院麻醉科，云南昆明 650051；2.昆明医科大学影像系，云南昆明 650500）

先天性心脏病（congenital heart disease,CHD）是新生儿最为常见的先天畸形之一，发病率占全部活产婴儿的7%～8%，是导致人类孕期流产、死胎和新生儿发育缺陷甚至死亡的主要原因之一[1]。心脏胚胎发育过程中，细胞的生物学行为和功能改变所致的心脏发育异常是CHD的始动环节[2]。心脏发育涉及许多相关基因和多条信号通路，精确调控细胞的增殖、迁移和分化，其中任意基因的异常所引起的心脏发育受损都有可能导致CHD的发生[2]。非编码微小RNA（microRNA、miRNAs）被 报 道 可 通 过 促 进mRNA降解或阻断蛋白质翻译，参与基因转录后调控。近期多项研究表明，miRNAs广泛参与到细胞代谢、增殖和凋亡等的调节过程[3]，与心脏发育、心脏疾病的发生密切相关[4-5]。例如，miR-34a通过调节Notch通路信号转导参与心脏发育调控，增加了小鼠CHD风险[6]。miR-29c也被报道调控P19细胞的生物学行为，与CHD发生相关[7]。miR-29b-3p被报道在CHD患者血清中异常低表达[8]，但对于miR-29b-3p在CHD的作用机制未见报道。本研究旨在进一步研究CHD的发病和调控过程中miR-29b-3p的作用和分子机制，为探寻新的诊断标志物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂P19细胞购自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection,ATCC），Taq⁃Man MicroRNA逆转录试剂盒购自美国Life Technology公司；CCK-8试剂盒购自上海麒盟生物科技有限公司；Lipofactamine 3000、Trizol提取试剂盒、GeneTai⁃lor Site-Directed Mutagenesis System购自美国Invit⁃rogen公司；α-MEM培养基、胎牛血清FBS、青霉素、链霉素、2.5 mL/L胰酶购自美国Gibco公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）购自美国Sigma公司；兔抗鼠cTnT、Mef2c、GATA 4抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自英国Abcam公司；miR-29b-3p mimic、miR-29b-3p inhibitor、pc-PTEN购自上海吉玛公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自上海碧云天公司；Dual-Luciferase Reporter System购自美国GeneCopoeia公司。

1.2 临床样本选择2019年6月至2020年2月就诊于本院心外科的24例先天性心脏病患儿，年龄1～8岁，男女各12例；对照组为24例年龄相仿的健康儿童，分别采集2组研究对象的外周血5 mL。先天性心脏病患者包括房间隔缺损11例、室间隔缺损10例、法洛四联症2例、动脉导管未闭1例，均具有典型的临床表现，经过体检、心电图及心脏彩超诊断，并经外科手术证实为先天性心脏病。本研究经过本院伦理委员会的批准，研究对象均已签署知情同意书。

1.3 细胞培养将P19细胞转移到含100 mL/L FBS、100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素的α-MEM完全培养基中，于37℃、50 mL/L CO2培养箱中培养。每2 d更换新鲜培养液，根据细胞生长情况用胰酶消化传代。

1.4 细胞转染取对数生长期P19细胞胰酶消化后，以3×105/孔密度接种于六孔板中，用无抗生素的α-MEM完全培养基，于37℃、50 mL/L CO2培养箱中培养48 h，细胞融合度至60%～70%。参照操作说明用Lipofactamine 3000转染miR-29b-3p mimic、miR-29b-3p inhibitor、pc-PTEN至P19细胞，孵育6～8 h后，更换为含抗生素的α-MEM完全培养基，RT-qPCR检测转染效果。

1.5 RT-qPCR检测miR-29b-3p的表达Trizol一步法提取细胞总RNA，取2μL RNA用NanoDrop2000核酸蛋白测定仪测定RNA浓度，并分装保存于−80℃。TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒将RNA合成为cDNA。上样至PCR仪进行PCR扩增，反应条件为：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40个循环。miR-29b-3p引物序列为Forward:TAGCAC⁃CATTTGAAATCAGTGTT；Reverse:CTGGTTTCA⁃CATGGTGGC。U6引物序列为Forward:CGCTTC⁃GGCAGCACATATACTAAAATTGGAAC；Reverse:GCTTCACGAATTTGCGTGTCATCCTGC。结果采用2-ΔΔCT法，以U 6为内参计算miR-29b-3p的相对表达量。

1.6 DMSO诱导心肌样分化用2.5 mL/L胰酶消化细胞转染后正常贴壁培养的P19细胞，以5×105～7×105/mL密度接种于10 cm含诱导培养基（含10 mL/L DMSO、100 mL/L FBS、100 mg/L链霉素和100 U/mL青霉素的α-MEM完全培养基）的Petri细菌培养皿，置于37℃、50mL/L CO2培养箱中悬浮培养。诱导培养至第8天，收集心肌样细胞进行Western blotting检测。

1.7 CCK-8检测细胞增殖取P19细胞胰酶消化离心，分别收集各组细胞制备成浓度为1×105/mL的单细胞悬液，每孔200μL接种于96孔板中，每组设置3个复孔，做好标记。于37℃、50mL/L CO2培养箱中培养，每2 d换液1次。每隔24 h进行CCK-8检测：每孔加入CCK-8试剂10μL混匀，孵育2 h，酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度值。

1.8 Transwell检测细胞迁移取P19样细胞消化，制成浓度为1×105/mL的单细胞悬液，在Transwell上室加入200μL细胞悬液，下室加入含100 mL/L FBS的α-MEM培养基，每组细胞设置3个复孔，置于37℃、50 mL/L CO2培养箱中继续培养48 h后取出小室。轻轻用棉签拭除上室细胞，迁移到下室的细胞用40 g/L多聚甲醛固定15 min，然后结晶紫染色10 min，显微镜下观察并拍摄照片。

1.9 Westernblotting检测蛋白水平诱导10 d后，按照蛋白提取试剂盒操作说明提取心肌样细胞的总蛋白，BCA法测蛋白浓度，蛋白与上样缓冲液混合，煮沸5 min。取等量的蛋白用100 g/L的分离胶进行电泳。电泳结束之后，在冰浴下转印蛋白至硝酸纤维素膜上，转膜2 h。50 g/L脱脂奶粉溶液室温封闭90 min，以兔抗人cTnT、Mef2c和GATA 4抗体作为一抗，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次10 min。接着加羊抗兔二抗，37℃孵育90 min，TBST清洗3次，每次10 min。于暗室中采用超敏ECL化学发光试剂盒显影定影，Image J分析条带灰度值，以GAPDH作为内参。P19细胞PTEN水平检测同上。

1.10 双荧光素酶报告基因实验将PTEN 3′UTR序列经PCR扩增，将其产物连接到p GL 3质粒XbaⅠ酶切位点构建野生型WT报告基因质粒。采用Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System试剂盒，突变PTEN 3′UTR上结合位点，构建突变型MUT报告基因质粒。将空载体、miR-29b-3p mimic、WT和MUT质粒转染至对数生长期293T细胞，细胞转染24 h后，按照Dual-Luciferase Reporter System说明检测荧光素酶活性。

1.11 统计学处理所有实验均设置3次重复，所得数据用生物统计学软件SPSS 13.0进行分析。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-29b-3p在CHD患者外周血清中和心肌分化诱导剂诱导下的表达情况RT-qPCR检测结果显示，miR-29b-3p在CHD患者外周血清中的水平显著低于健康对照组（t=5.083，P=0.001，图1A），且在心肌分化诱导剂DMSO诱导下，miR-29b-3p表达水平上调，第8、第12、第16天与对照组相比诱导后差异有统计学意义（t=5.883，P=0.004，图1B）。

图1 miR-29b-3p在CHD患者外周血清中和心肌分化诱导剂诱导下的表达情况Fig.1 The expression of miR-29b-3p in the peripheral serum of CHD patients and induced by myocardial differenti⁃ation inducer

2.2 敲降miR-29b-3p对心肌样细胞增殖、迁移和分化的作用RT-qPCR结果表明，转染miR-29b-3p inhibitor显著抑制了miR-29b-3p在P19细胞中的表达（t=6.380，P=0.002，图2A）。CCK-8实验和Transwell迁移检测已分化心肌样细胞的增殖和迁移，结果显示相比对照组，敲降miR-29b-3p对心肌样细胞的增殖和迁移均有显著抑制作用（图2B、图2C和表1）。Western blotting实验结果显示，敲降miR-29b-3p显著抑制心肌特化基因（cTnT、GATA 4、Mef2c）表达，miR-29b-3p inhibitor组与对照组差异有统计学意义。诱导P19细胞心肌样分化晚期miR-29b-3p表达显著高于早期，敲降miR-29b-3p抑制P19细胞向心肌细胞分化。

表1 CCK-8检测细胞增殖活力Tab.1 CCK-8 detected cell proliferation activity （±s）

表1 CCK-8检测细胞增殖活力Tab.1 CCK-8 detected cell proliferation activity （±s）

与NC组比较，*P<0.05。

组别NC miR-29b-3p inhibitor时间(d)0 0.22±0.04 0.21±0.04 1 0.36±0.05 0.28±0.04 2 0.63±0.06 0.41±0.03 3 0.86±0.05 0.65±0.07 4 1.18±1.3 0.83±0.07 5 1.3±0.05 0.94±0.06*

图2 敲降miR-29b-3p对P19细胞增殖、迁移和分化的作用Fig.2 Effects of miR-29b-3p knockdown on the proliferation,migration and differentiation of P19 cells

2.3 miR-29b-3p对PTEN的靶向调控生物信息学数据库StarBase预测结果显示，miR-29b-3p和PTEN人类基因和鼠基因中有一致的保守结合位点（图3A），双荧光素酶报告基因实验结果显示（图3B），过表达miR-29b-3p显著抑制p GL 3-PTEN-WT野生型载体的荧光素酶活性，而对突变型的载体无显著影响。进一步Western blotting实验结果显示（图3C），过表达miR-29b-3p下调了PTEN的表达。miR-29b-3p靶向PTEN并负调控其表达。

图3 miR-29b-3p对PTEN的靶向调控Fig.3 miR-29b-3p targeted and regulated PT EN

2.4 miR-29b-3p靶向PTEN对心肌样细胞增殖、迁移和分化的作用Western blotting检测结果显示，相比对照组，转染pc-PTEN引起PTEN表达显著上调（t=6.694，P=0.002），而同时转染pc-PTEN和miR-29b-3p mimic组PTEN蛋白水平恢复至与对照组无统计学差异（图4A）。倒置显微镜观察DMSO诱导下第0～第10天中P19分化状态，结果显示，相比对照组，过表达PTEN显著抑制P19细胞心肌样分化，而同时过表达PTEN和miR-29b-3p与对照组P19细胞分化过程无统计学差异（图4B）。DMSO诱导10 d后进行CCK-8增殖和Transwell迁移检测，结果显示，相比对照组，过表达PTEN显著抑制心肌样细胞增殖和迁移，而同时过表达PTEN和miR-29b-3p对心肌样细胞增殖和迁移的影响与对照组相比无统计学差异（图4B、图4C、表2）。miR-29b-3p通过负调控PTEN表达，促进P19细胞分化和心肌样细胞增殖、迁移。

表2 CCK-8检测细胞增殖活力Tab.2 CCK-8 detected cell proliferation activity （±s）

表2 CCK-8检测细胞增殖活力Tab.2 CCK-8 detected cell proliferation activity （±s）

与NC组比较，*P<0.05，**P<0.01；与pc-PTEN组比较，#P<0.05。

组别NC pc-PTEN pc-PTEN+miR-29b-3p mimic时间(d)0 0.20±0.05 0.20±0.04 0.21±0.04 1 0.34±0.05 0.26±0.05 0.36±0.05 2 0.68±0.06 0.34±0.05 0.58±0.05 3 0.9±0.05 0.52±0.04 0.81±0.05 4 1.20±0.05 0.74±0.06 1.00±0.06 5 1.31±0.04 0.84±0.07*1.11±0.06#

图4 miR-29b-3p靶向PTEN对P19细胞增殖、迁移和分化的作用Fig.4 Effects of miR-29b-3p on the proliferation,migration and differentiation of P19 cells by targeting PTEN

3 讨 论

心脏是胚胎发生过程中最早形成的具有形态和功能的器官，维持心脏发育稳态是个体生存的基础，涉及精确的细胞增殖、迁移分化，其中多条通路参与调控，如Wnt通路、BMP通路、AKT通路、Noctch通路等[9-10]。先天性心脏病是先天性畸形中最常见的一种，涉及心脏组织本身及大血管的畸形，造成心脏结构或功能的病变，是导致婴幼儿死亡的主要原因。但大多数先天性心脏缺陷的原因仍不明确，越来越多研究显示了表观遗传学在心脏发育中的重要作用，因此探究胚胎心脏形成和发育过程中的基因调控机制，可以为先天性心脏病的防治提供新思路。MicroRNA（miRNAs）是内源性长度为20～26个核苷酸的非编码RNA，miRNA与其靶基因的3′端非翻译区（3′-UTR）相互作用，以促进其mRNA降解，抑制蛋白质翻译，在基因表达的转录后调控中起着重要作用。miRNA可作为心脏信号通路和基因转录中的与环境交互的“分子开关”，通过影响时序发育、细胞分化、细胞的增殖和凋亡，参与调节心脏发育和再生生

物学的各个方面[3]。在先天性心脏病中功能活跃，miR-29c抑制P19细胞的增殖并促进其凋亡，过表达miR-29c导致斑马鱼心率减慢、心包水肿以及心脏循环障碍[7]。此外，miRNA在循环中稳定性高，在母体、胎儿或新生儿血清中的miRNA表达谱可能成为心脏疾病诊断和预后的重要指标[11]。

本研究发现，miR-29b-3p在先天性心脏病患者外周血中异常低表达。研究报道在miR-29b-3p心力衰竭患者外周血中水平降低，miR-29b-3p已被多次报道调控细胞的增殖、迁移和侵袭[12-13]。ALTAF等[8]研究显示，miR-29b-3p在CHD患者外周血中表达较健康人群降低。P19细胞是一种在体外培养的多能性细胞，作为心肌细胞模型广泛应用于心脏发育和先天性心脏病发病机制的研究中[14]。本研究通过细胞转染外源性调节了P19细胞miR-29b-3p，确定了miR-29b-3p异常低表达介导心脏发育异常的分子机制。miR-29b-3p引起靶基因PTEN表达上调，抑制P19细胞增殖、迁移和分化。cTnT、Mef2c及GATA 4均为心肌细胞的标志性基因，常用来鉴定心肌细胞的形成，在心肌分化功能性miRNA表达失调的情况下，该3个基因表达也会发生变化[15]。本研究Western blotting结果证实，miR-29b-3p低表达的同时阻碍了心肌分化基因的表达，阻碍其向心肌样分化。

PTEN被广泛报道为一个肿瘤相关基因，是PI3K/AKT通路的内源抑制分子[16]。最新研究表明，在先天性心脏病患者中发现了较高的PTEN突变率[17]，并且作为miRNA的靶基因，PTEN同样在心脏发育和心肌分化中有重要作用，GLASS等[18]研究表明，PTEN作为miR-1的靶基因调控胚胎干细胞的心肌样分化。近年有研究发现，miR-301a通过靶向抑制PTEN表达，介导AKT通路促进心肌分化[19]。PI3K/Akt3信号通路参与心脏缺血/再灌注损伤和心肌细胞重塑[20-21]，也通过调节心脏祖细胞增殖影响正常心脏发育[22]。生物信息学工具预测PTEN为miR-29b-3p的潜在靶基因，本研究证实P19细胞中miR-29b-3p可靶向负调控PTEN的表达，并且进一步的功能恢复实验也证实，PTEN作为miR-29b-3p的下游分子，可以抑制miR-29b-3p的生物学功能，恢复P19细胞的增殖、迁移和分化水平。

综上所述，敲降miR-29b-3p表达，可以进而上调PTEN表达，最终抑制细胞增殖、迁移和心肌样分化，这为阐明miR-29b-3p调控心脏发育和致胚胎心脏发育畸形的作用机制奠定了基础，为研究先天性心脏病的治疗提供了新的思路。