华蟾素通过wee1蛋白调控卵巢癌细胞SKOV3的增殖与凋亡

郭 镜，高 月

（1.锦州医科大学附属第三医院康复科，辽宁锦州 121001；2.重庆市北碚区中医院检验科，重庆 400700）

人wee1基因位于11p15.1～11p15.3，编码含有647个氨基酸的蛋白质，是一种属于丝氨酸/苏氨酸家族的蛋白激酶。wee1蛋白激酶在人类多种恶性肿瘤中呈高表达，参与肿瘤的各种生物学行为[1-2]。本课题组前期研究发现，wee1激酶在卵巢癌组织中高表达，沉默wee1表达能够抑制卵巢癌细胞的增殖与侵袭转移。华蟾素(cinobufotalin,CINO)是传统中药材蟾皮的水煎煮提取物，具有清热、解毒、消肿、化瘀等功效，并对肿瘤具有较强的抑制作用[3-4]。文献报道，CINO在卵巢癌中能够抑制卵巢癌细胞的生长、促进细胞凋亡和抑制细胞侵袭转移[5-6]，但尚未见报道其抑制作用是否与wee1的表达有关。本研究对此进行实验观察，以明确wee1的表达变化与CINO治疗卵巢癌的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料人卵巢癌SKOV 3细胞购自中科院上海细胞库，RPMI-1640培养基购自美国Invitrogen公司，CCK 8试剂盒购自Promega公司；pcDNA-wee1过表达载体由上海吉玛基因公司构建。鼠抗人wee1、Bcl-2、Bax、Caspase-3单克隆抗体和兔抗鼠β-actin多克隆抗体购自Abways公司。Annexin V-FITC/PI试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。

1.2 构建并鉴定转染wee1过表达SKOV3细胞SKOV 3细胞培养于含100 mL/L FBS的RPMI-1640培养液，37℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中。按1×105/孔细胞接种于6孔板，待细胞生长达50%汇合时，按Lipofectamine 2000说明书转染细胞。wee1过表达组转染pcDNA-wee1过表达载体，另设无转染组、转染pcDNA组。

Real-time PCR检测转染细胞wee1的表达：转染48 h，收集各组细胞提取总RNA并测定RNA浓度。1μg RNA为模板，按RT-PCR逆转录试剂盒合成cDNA；1μL cDNA为模板，进行Real-time PCR反应。Wee1基因正义链5'-CCACCACCCT-GCCAGT⁃TAA-3'，反 义 链5'-TAAACTTTTGT-GCAAC⁃CAGGGTAA-3'。反应条件：95℃10 s，95℃5 s，60℃15 s，72℃15 s，45个循环。基因相对表达用2-△△CT法确定。

Western blotting检测转染细胞wee1的表达：转染48 h，收集各组细胞提取蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。用80 g/L SDS-PAGE电泳后，将目标蛋白转移到PVDF膜上，用50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗鼠抗人wee1（1∶500稀释），4℃孵育过夜。TBST液洗膜5次，加入二抗，室温孵育2 h。ECL曝光并检测蛋白表达。以β-actin作为内参，蛋白相对表达=目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.3 CCK8实验检测细胞增殖将转染pcDNAwee1并鉴定成功过表达的SKOV 3细胞培养至约80%汇合，于96孔板进行分组干预，即空白对照组、CINO组（10μg/mL）、CINO+pcDNA-wee1组和pcDNAwee1组。每组设3个复孔。分别干预作用24、48、72 h，加入10μL/孔CCK 8试剂，37℃培养箱孵育2 h，酶标仪检测吸光度（A）值(波长450 nm)。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率按1.3项分组干预培养48 h，收集细胞，用PBS缓冲液冲洗2次，离心弃掉上清，加入1 mL PBS混匀，加入5μL Annexin V-FITC振荡混匀，4℃孵育15 min，加入5μL PI，孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率，上述实验重复3次。

1.5 Westernblotting检测Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达按1.3项分组干预培养48 h，收集细胞提取蛋白，按1.2项中实验步骤，进行电泳，转膜，封闭后，分别加入抗Caspase-3（1∶200）、Bcl-2（1∶500）和Bax（1∶500）4℃孵育过夜。洗膜，加入二抗，室温孵育2 h。ECL曝光并检测各蛋白表达。

1.6 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，两样本的均数比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 wee1过表达SKOV3细胞的鉴定Real-time PCR结果显示，与无转染组和转染pcDNA组比较，pcDNA-wee1组转染48 h，wee1 mRNA表达明显增高；Western blotting结果显示，pcDNA-wee1组wee1蛋白表达明显高于其他组(P<0.05，图1)。

图1 wee1过表达SKOV3细胞的mRNA（A）与蛋白（B）表达情况Fig.1 The mRNA（A）and protein（B）expressions of wee1 in SKOV 3 cells

2.2 CINO和（或）pcDNA-wee1对SKOV3细胞增殖的影响CCK 8检测结果显示，培养24、48、72 h，与空白对照组相比，pcDNA-wee1组促进SKOV 3细胞生长(P<0.05)，而CINO组SKOV 3细胞生长明显被抑制，且均与时间呈正比(P<0.05)；与空白对照组相比，CINO+pcDNA-wee1组SKOV 3细胞生长无明显变化(P>0.05)。而与pcDNA-wee1组相比，CINO和CINO+pcDNA-wee1组SKOV 3细胞的生长抑制，并与时间呈正比(P<0.05，图2)。说明CINO可能是通过影响wee1表达而抑制SKOV 3细胞的生长。

图2 CINO和（或）pcDNA-wee1对SKOV3细胞增殖的影响Fig.2 The effects of CINO and/or pcDNA-wee1 on the proliferation of SKOV 3 cells

2.3 CINO和（或）pcDNA-wee1对SKOV3细胞凋亡的影响流式细胞仪结果显示，与空白对照组相比，pcDNA-wee1组作用48 h时SKOV 3细胞凋亡抑制(P<0.05)；而CINO组SKOV 3细胞凋亡增高(P<0.05)；CINO+pcDNA-wee1组SKOV 3细胞的凋亡情况无明显变化(P>0.05)。与pcDNA-wee1组相比，CINO组和CINO+pcDNA-wee1组SKOV 3细胞凋亡均增高(P<0.05，图3)，说明CINO可能是通过抑制wee1表达而促进SKOV 3细胞凋亡。

图3CINO和（或）pcDNA-wee1对SKOV3细胞凋亡的影响Fig.3 The effects of CINO and/or pcDNA-wee1 on the cell apoptosis rate of SKOV 3 cells

2.4 CINO和（或）pcDNA-wee1对SKOV3细胞wee1表达的影响与空白对照组相比，pcDNAwee1组wee1的表达明显增加，而CINO组wee1的表达均被抑制（P<0.05）；与空白对照组相比，CINO+pcDNA-wee1组wee1的表达无明显变化（P>0.05)。与pcDNA-wee1组相比，CINO组和CINO+pcDNAwee1组wee1的表达均被抑制(P<0.05，图4)。这表明CINO可抑制wee1表达。

图4 各组细胞中wee1蛋白的表达情况Fig.4 The expression of wee1 protein on SKOV 3 cells in different groups

2.5 CINO和（或）pcDNA-wee1对Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达的影响与空白对照组相比，CINO组Caspase-3、Bax蛋白表达上调，而Bcl-2蛋白表达下调；pcDNA-wee1组Caspase-3、Bax蛋白的表达下调，而Bcl-2蛋白表达上调(P<0.05)；CINO+pcDNAwee1组Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表达无明显变化（P>0.05，图5)。

图5 各组细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达情况Fig.5 The expressions of Caspase-3,Bax and Bcl-2 proteins on SKOV 3 cells

3 讨 论

中药已广泛应用于肿瘤的临床治疗中，在抑制肿瘤发展、减轻肿瘤患者病痛、提高患者免疫功能、延长患者寿命等方面发挥重要作用[7]。CINO是干蟾皮的提取物，其主要活性成分为多肽类、蟾毒配基类、吲哚生物碱类等。《神农本草经》中曾记载“蟾蜍味辛寒，主邪气，破癥坚血、痈肿、阴疮，服之不患热病”，为CINO在现代医学中应用于临床治疗肿瘤提供经典的理论依据[8]。近年来，CINO已广泛应用于消化道肿瘤、肺癌、非霍奇金淋巴瘤等肿瘤治疗中[9-11]。无论单独使用还是与化疗药物联合应用，均取得了良好疗效。研究发现，CINO抗肿瘤分子机制主要是由死亡受体介导的外源性信号通路和线粒体参与的内源性信号通路，在多种酶和蛋白质参与下抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡[12]。本课题组前期研究发现，CINO可以抑制卵巢癌细胞的生长并促进其凋亡[13]，但具体机制尚不清楚。

人wee1基因位于11p15.1～11p15.3，编码含有647个氨基酸的蛋白质。wee1除了在胚胎发育、神经元极化等方面发挥作用外，还调控着DNA复制、组蛋白转录等生物学进程，一旦这些行为异常，可导致基因组不稳，最终引起恶性肿瘤的发生[14-16]。文献报道，wee1蛋白激酶在胃癌、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中高表达，干扰wee1基因能够抑制结直肠癌细胞增殖侵袭，wee1作为一种潜在的肿瘤治疗靶点已被学者关注[17-19]。本课题组前期研究发现，wee1激酶在卵巢癌组织中高表达，沉默wee1能够抑制卵巢癌细胞的增殖与侵袭转移。本研究明确了CINO可明显抑制pcDNA-wee1促进卵巢癌SKOV 3细胞生长，并且这种作用具有时间依赖性，同时CINO和pcDNAwee1联合作用时，CINO可抑制pcDNA-wee1细胞中wee1过表达而增强的作用，证实CINO能够抑制卵巢癌SKOV 3细胞wee1的表达。

Caspase家族是细胞凋亡进程中的主要执行者，其中Caspase-3是家族中的重要成员，在促进细胞凋亡过程中发挥关键的枢纽作用[20]。Bcl-2是Caspase-3的上游调控蛋白，可抑制Caspase-3的表达，进而抑制细胞凋亡，而Bax则具有促细胞凋亡的作用[21]。本研究结果提示，pcDNA-wee1可降低SKOV 3细胞凋亡，下调Caspase-3和Bax的表达，上调Bcl-2的表达；而当CINO和pcDNA-wee1联合作用时，CINO可明显降低pcDNA-wee1抑制SKOV 3细胞凋亡的作用，上调Caspase-3和Bax的表达，下调Bcl-2的表达。说明CINO可通过抑制wee1来增强Caspase-3和Bax的表达，降低Bcl-2的表达，进而促进卵巢癌SKOV 3细胞的凋亡。

综上所述，本研究表明，在卵巢癌细胞中，CINO能够抑制SKOV 3细胞增殖，诱导其凋亡，其机制可能是CINO抑制wee1的表达，进而使Bax和Caspase-3的蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达降低，启动了内源性凋亡通路，促进细胞凋亡。这为进一步研究CINO在卵巢癌中的作用机制奠定了一定的理论基础。