N-乙酰半胱氨酸对香烟烟雾提取物诱导的气道上皮细胞线粒体过氧化损伤的保护作用

张 明，张 莉，杨 侠，单 虎，张秋红，张红妮，张 洁，李雅莉

（1.西安交通大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，陕西西安 710004；2.西安市第九医院泌尿外科，陕西西安 710054）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo⁃nary disease,COPD）是一种常见的以持续呼吸道症状及气流受限为特征的可预防和治疗的肺部疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展。我国40岁以上人群中COPD的患病率为13.7%，总体患病人数接近1亿[1]。COPD是环境因素和遗传因素相互作用的多基因疾病，可能与吸烟、空气污染、生物燃料、职业粉尘暴露、基因异常、肺发育异常和老龄化等多种因素有关[2]。随着吸烟人口增多、人口老龄化和环境污染加重，其发病率将呈继续上升趋势，给患者、家庭及社会带来巨大负担。吸烟是COPD发病的主要病因，但其所致COPD的发病机制，迄今尚不完全清楚。

气道上皮细胞是呼吸系统与外界接触的第一道天然屏障，其过氧化应激是COPD发生的重要机制[3]。线粒体是细胞氧化应激的调节中枢，故气道上皮细胞线粒体过氧化损伤在COPD的发病中起重要作用[4]。Sirtuins（Sirt）蛋白是一组依赖烟碱腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化蛋白家族，家族中有7个成员，其中定位于线粒体的Sirt3几乎参与调节线粒体的大部分功能[5]，如活性氧（reactive oxygen species,ROS）清除、ATP产生、有氧氧化等，从而减轻线粒体内过氧化应激，发挥对线粒体的保护作用，其机制与激活锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase,MnSOD）等信号分子有关[6-7]。本团队最近研究亦表明，Sirt3通过调节MnSOD的表达和活性，减轻COPD气道上皮细胞线粒体损伤[8]。因此，探讨香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract,CSE）导致气道上皮细胞线粒体损伤的机制，有助于进一步阐明COPD发病机制。

N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）是L-半胱氨酸乙酰化的衍生物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理学特征，已被广泛用于COPD、特发性肺间质纤维化、急性肺损伤等多种呼吸系统疾病的治疗[9]。曾有研究表明，NAC可抑制CSE诱导的气道上皮细胞炎症反应[10]。但迄今仍不清楚NAC在CSE诱导的气道上皮细胞线粒体过氧化损伤中的作用及其机制。因此，本研究对此进行观察，以期阐明NAC减轻COPD发病的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料1R6F标准香烟购自美国肯塔基大学，气道上皮细胞系BEAS-2B购自美国ATCC细胞库；NAC、MTT购自Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清购自Gibco公司；MitoSOX、JC-1、TMRM、DAPI均 购 自Thermo Fisher Scientific；Sirt3、MnSOD和β-actin抗体购自Cell Signaling Technology；HRP标记的山羊抗兔二抗及ECL化学发光试剂盒购自Pierce Biotechnology；MnSOD活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 CSE制备参照文献制备CSE[11]，即去除1R6F香烟滤嘴，将香烟连接在长约50 mm的橡皮管上，橡皮管另一端连接60 mL注射器，点燃香烟并模拟人实际吸烟情况，每分钟吸1次，每次30 mL持续2 s，将香烟烟雾注入含10 mL RPMI 1640培养基的玻璃瓶中，摇晃玻璃瓶使烟雾充分溶解。共收集10管（300 mL）香烟烟雾，溶解于10 mL的RPMI 1640培养基中，则每1 mL培养基含有30 mL的香烟烟雾被定义为原液。原液用0.22µm滤膜过滤除菌后作为100%CSE原液，分装后−80℃保存备用。实验时应快速解冻，30 min内用于实验。根据实验分组，用培养基将100%CSE稀释至实验所需浓度。

1.3 实验分组常规复苏BEAS-2B气道上皮细胞，于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基，37℃、50 mL/L的CO2培养箱中培养，每2 d换液1次。取对数生长期细胞进行实验分组。正常对照组：常规培养气道上皮细胞；7.5%CSE组：7.5%CSE（75 mL/L CSE）干预气道上皮细胞24 h；7.5%CSE+NAC组：加入5 mmol/L的NAC预处理气道上皮细胞2 h，而后7.5%CSE干预24 h。

1.4 MTT检测细胞活性各组细胞处理后，向每孔加入5 g/L的MTT 20μL，继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入150μL DMSO摇匀，应用酶标仪读取490 nm波长下的吸光度（A）值。细胞活性（%）=（实验孔A值−空白孔A值）/（对照孔A值−空白孔A值）×100%。

1.5 MitoSOX检测线粒体内ROS水平细胞接种于6孔培养板，按照实验分组给予相应处理，PBS快速清洗培养板中的细胞，加入线粒体染料MitoSOX并于细胞培养箱中孵育10 min，40 g/L多聚甲醛固定，DAPI复染细胞核5 min，PBS洗涤3次，封片后在荧光显微镜下观察红色（激发波长510 nm、发射波长580 nm）荧光强度，最后应用Image J软件分析Mito⁃SOX荧光强度，其强弱反映线粒体内ROS水平。

1.6 线粒体染料JC-1检测细胞MMP水平按1.5项进行细胞分组干预后，加入线粒体染料JC-1于细胞培养箱中孵育细胞30 min，40 g/L多聚甲醛固定，PBS洗涤3次，封片后在荧光显微镜下分别测定红色（激发波长488 nm、发射波长590 nm）、绿色（激发波长488 nm、发射波长529 nm）荧光强度，并计算红光与绿光的比值以测定MMP水平。

1.7 TMRM检测细胞MMP水平各组细胞处理后，2.5 g/L胰酶-EDTA消化细胞，制成单细胞悬液，再用PBS离心洗涤，加入TMRM后于细胞培养箱中孵育30 min，PBS再次洗涤后,流式细胞仪检测TMRM荧光强度，反映细胞MMP水平。

1.8 Westernblotting检测蛋白表达RIPA裂解液分别提取各组气道上皮细胞总蛋白，应用BCA法测定蛋白浓度。取25μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，湿转法将蛋白转移至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入一抗（Sirt3、MnSOD、β-actin 1∶1 000），4℃孵育过夜，洗膜后加入HRP标记的二抗室温下孵育1 h，充分洗涤后与ECL反应，化学发光成像系统收集荧光，最后用Image J软件分析荧光强度。

1.9 比色法测定MnSOD活性各组细胞处理后，分别收集细胞总蛋白，应用BCA法测定蛋白浓度，参照MnSOD活性检测试剂盒说明书，通过比色法检测MnSOD活性。

1.10 统计学分析利用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。每组实验重复3次，数据以均数±标准差（±s）表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，再应用LSD检验进行两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NAC对CSE诱导的气道上皮细胞活性下降的影响各组刺激24 h，7.5%CSE组的气道上皮细胞活性降低至正常对照组的60.2%，差异具有统计学意义（LSD-t=5.73，P<0.05）；5 mmol/L的NAC预处理（7.5%CSE+NAC组）可显著改善CSE诱导的细胞活性降低，与7.5%CSE组比较，差异有统计学意义（LSD-t=3.08，P<0.05，图1）。

图1 CSE对气道上皮细胞活性的影响及NAC的干预作用Fig.1 Effect of CSE on the viability of airway epithelial cells and the pretreatment effect of NAC

2.2 CSE促进气道上皮细胞线粒体ROS产生及NAC的干预作用与正常对照组相比，7.5%CSE组气道上皮细胞线粒体内ROS含量显著增加（LSD-t=8.21，P<0.05）；5 mmol/L的NAC预处理可使气道上皮细胞线粒体内ROS水平降低至7.5%CSE组的67.6%，差异具有统计学意义（LSD-t=3.40，P<0.05，图2）。

图2 CSE对气道上皮细胞线粒体ROS的影响及NAC的干预作用Fig.2 The effect of CSE on mitochondrial ROS in airway epithelial cells and the pretreatment effect of NAC

2.3 CSE降低气道上皮细胞MMP水平及NAC的干预作用JC-1检测结果显示，JC-1在正常对照组线粒体聚集产生红色荧光；当7.5%CSE组的细胞线粒体内JC-1聚合物减少，红色荧光强度明显减弱，而绿色荧光显著增强；与7.5%CSE组相比，NAC预处理可显著增加气道上皮细胞内红色荧光强度，减少绿色荧光强度；应用红绿荧光的相对比值反映MMP水平，结果提示CSE可下调气道上皮细胞MMP水平，NAC预处理可显著上调MMP水平，差异具有统计学意义（F=74.77，P<0.05，图3）。

图3 CSE对气道上皮细胞MMP的影响及NAC干预作用Fig.3 The effect of CSE on MMP in airway epithelial cells and the pretreatment effect of NAC

此外，应用TMRM荧光染料进一步检测细胞内MMP水平，定量分析显示，7.5%CSE组的MMP水平较正常对照组显著降低（LSD-t=11.73，P<0.01）；5 mmol/L的NAC预处理可明显改善MMP水平，与7.5%CSE组相比差异有统计学意义（LSD-t=4.04，P<0.01，图4）。

图4 NAC预处理减轻CSE诱导的气道上皮细胞MMP下降Fig.4 CSE-induced MMP decline was attenuated by the pretreatment with NAC in airway epithelial cells

2.4 CSE下调气道上皮细胞中Sirt3-MnSOD通路蛋白表达及NAC的干预作用与正常对照组相比，7.5%CSE组气道上皮细胞中Sirt3和MnSOD蛋白表达以及MnSOD活性均显著降低（LSD-t=6.01、5.01、4.54，P均<0.01）；7.5%CSE+NAC组气道上皮细胞中Sirt3和MnSOD蛋白表达以及MnSOD活性较7.5%CSE组均显著升高，差异具有统计学意义（LSD-t=2.68、2.54、2.59，P均<0.05，图5）。

图5 CSE对气道上皮细胞Sirt3-MnSOD通路的影响及NAC的干预作用Fig.5 The effect of CSE on Sirt3-MnSOD pathway in airway epithelial cells and the pretreatment effect of NAC

3 讨 论

吸烟是COPD等多种呼吸系统疾病的常见危险因素，然而其作用机制迄今尚不完全清楚。香烟烟雾最先作用于人支气管上皮细胞，诱发气道上皮炎症反应和过氧化应激，导致气道上皮细胞功能失调及COPD发病[12]。香烟中含有ROS等上千种化学物质，然而其中的气相ROS几乎不能直接进入气道上皮细胞和血液循环系统[13]。因此，香烟通过诱导气道上皮细胞内ROS产生，继而加重COPD患者气道上皮细胞及循环系统内的过氧化应激。但是香烟诱导的气道上皮细胞内ROS产生机制仍需进一步研究。

线粒体是动物细胞内ATP的主要合成场所，在产生能量的同时，也持续生成大量ROS，是细胞内ROS的主要来源和靶位。前期研究表明，CSE可通过上调衔接蛋白p66Shc表达及其线粒体转位，促进气道上皮细胞线粒体内ROS生成，导致气道上皮细胞线粒体过氧化损伤[14]；且香烟烟雾诱导的COPD大鼠气道上皮线粒体存在严重损伤[8]。目前研究亦表明，多种与线粒体相关的信号分子参与COPD气道上皮线粒体损伤，如定位于线粒体的Sirt3在线粒体氧化应激中发挥重要作用[5,15]。既往文献报道，Sirt3不但可直接去乙酰化激活MnSOD，而且通过调控FOXO3a转录因子上调MnSOD基因表达，最终提高MnSOD活性及ROS的清除能力[16]。本研究组最近研究表明，Sirt3可通过上调MnSOD表达和活性，发挥对COPD气道上皮细胞线粒体的保护作用[8]。上述研究结果提示，上调Sirt3-MnSOD信号通路的活性可抑制COPD发生和发展。

在COPD的诸多治疗药物中，NAC因具有显著的粘液溶解、抗氧化、抗炎等药理学特征，已被广泛用于治疗和预防COPD[17]。目前研究表明，NAC的主要抗氧化作用机制如下[18]：①NAC通过去乙酰化衍变为半胱氨酸，而后进一步转换为还原型谷胱甘肽，清除细胞内ROS，稳定细胞膜及胞内膜相结构，改善细胞内酶类及蛋白质的功能；②NAC自身也是一种强抗氧化剂，能够直接清除羟自由基、过氧化氢及次氯酸等过氧化物质。然而尚未见文献报道NAC对COPD气道上皮细胞线粒体损伤的作用及其机制。

依据本课题组前期研究结果[14]，本研究应用7.5%CSE刺激气道上皮细胞建立COPD细胞模型，而后给予5 mmol/L的NAC干预。MTT实验结果示NAC可改善CSE诱导的细胞活性损伤，提示NAC对气道上皮细胞损伤发挥保护作用。在CSE刺激的气道上皮细胞中，线粒体内ROS含量增加、MMP水平降低，表明CSE可致气道上皮细胞线粒体过氧化损伤；而NAC干预可显著改善上述线粒体过氧化指标的变化，提示NAC可降低气道上皮细胞线粒体过氧化应激，发挥对CSE诱导的气道上皮细胞损伤保护作用。本研究亦发现，CSE可显著下调气道上皮细胞中Sirt3和MnSOD蛋白表达以及MnSOD活性，与本课题组前期研究结果保持一致[8]；NAC预处理可抑制CSE诱导的Sirt3-MnSOD通路蛋白表达下降和MnSOD活性的减低。因此，NAC通过调节Sirt3-MnSOD信号通路，发挥对CSE诱导的气道上皮细胞线粒体过氧化损伤的保护作用。本研究结果为进一步阐明NAC对COPD的预防和治疗作用提供有益依据。