牙髓血运重建术对年轻恒牙根部组织VEGF、NGF表达的影响

刘迪 史滨伟 陶冠男

近些年来临床上运用牙髓血液重建方法实现牙髓再生的病例多有报道[1-4]。牙髓血运重建术是治疗口腔疾病的一种新方法，不但对感染及坏死牙髓具有修复作用，而且能促使牙本质再生。干细胞、支架和生长因子分析以及发展适宜的环境，都对牙髓的再生过程起到不可或缺的重要作用。大量的体内外实验证明，生长因子能有效促进血管生成[5-6]，诱导根尖形成，但在实际的牙髓血运重建过程中，这些生长因子会有怎样的变化规律尚不清楚。本研究方法将对大鼠可以进行保护牙髓血运重建，建立动物学模型，观察年轻恒牙根组织牙髓再生过程中的神经细胞生长因子（nerve growth factor，NGF）和血管内皮细胞生长因子（vascular endosthort growth factor，VEGF）的表达能力情况，为牙髓血运重建后大鼠牙周组织的炎症吸收和愈合机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器和实验动物

三氧化物凝聚体（mineral trioxide aggregate，MTA）（登士柏公司，美国）；玻璃离子水门汀（glass-ionomer cement，GIC）；口腔显微镜（莱卡公司，德国）；RNA逆转录试剂（武汉博士德生物公司，中国）；SD大鼠（哈尔滨医科大学实验动物学部）。

1.2 研究方法

选取20只3.5周龄SPF级SD大鼠，体质量60～80 g，雌雄比例各半。随机取其中10只作为实验组。另外10只不作任何处理，以下颌第一磨牙为对照组。

麻醉剂采用戊巴比妥钠，腹腔注射。待翻正反射消失后，将SD大鼠固定于鼠板上，用口腔牵拉装置调节大鼠口腔角度，根据手术操作需要使其充分暴露口腔术区及下颌磨牙区。

对SD大鼠下颌第一磨牙进行牙髓血运重建：首先对作业术野进行消毒，用棉卷进行隔湿，保持整个过程无菌。用高速不锈钢球钻（＃1 / 4）将大鼠下颌第一磨牙的冠部开髓，用生理盐水冲洗根管腔，然后将手动不锈钢扩张针（30）插入根尖孔，使根尖周组织尽可能多地出血，并尽可能多地用血液填充根管。待牙颈部充满中国血液时，将无菌小棉球蘸湿生理进行盐水后轻微挤干，放置在根管口3～4 mm下；约10 min后，基本形成具有血凝块，取出小棉球，然后用MTA覆盖整个血凝块表面。最后使用玻璃离子水门汀（GIC）对其冠部进行填充，表面涂布凡士林。填充后，用探针探测填充边缘，确认填充稳定。术后正常喂食饮水，定期观察牙冠封闭情况和大鼠健康状况，如果发现填充体脱落，重新进行填充。

术后3周将20只大鼠处死，5只实验组与5只对照组进行分离下颌骨以及对照，进一步进行组织学观察和影像学观察。另外5只实验组与5只对照组进行VEGF和NGF的荧光光定量qRT－PCR的检测。

1.3 观察指标

1.3.1 影像学观察 戊巴比妥钠麻醉，4%多聚甲醛行心脏灌注。灌注后解剖取出下颌骨，放置于4%中性多聚甲醛中，固定24 h后，分别标记各个标本。标记后，通过X射线成像系统对样本进行扫描和成像。

1.3.2 组织学观察 戊巴比妥钠麻醉，4%多聚甲醛行心脏灌注。灌注后解剖分离下颌骨，将多余的硬组织和骨表面软组织去除后，先放置于15%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），脱钙在EDTA作用后2个月内进行，然后置于常规乙醇中脱水。石蜡包埋后，通过根尖孔沿牙齿长轴（切片厚度4μm）制作切片。

苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色观察：实验组和对照组分别取石蜡切片。在68℃～70℃烘烤30分钟后，脱蜡入水中，HE染色；然后，两名具有相同标准（Kappa=0.804）的测试人员在光学显微镜下观察每个牙根的组织切片，并根据以下参数和组织学类型进行评估。

参数分别为：（1）是否在管腔及根尖周围环境存在大量的炎症反应细胞；（2）是否在牙根牙本质内壁上有新生硬组织；（3）是否在根尖有硬组织沉积，令牙根长度可以增加；（4）根尖是否能够存在一个闭合的趋势；（5）是否在根管内存在一些新生的组织。

1.3.3 qRT－PCR检测 戊巴比妥钠麻醉大鼠后，多聚甲醛心脏灌注之前，在每一侧下颌骨的根管內组织及根尖周组织，收集到1个去RNA酶的微型离心管（eppendorf，EP）管，待降温后，将其放入液氮中，并储存在-80℃的冰箱中。提取组织总RNA，进行qRT－PCR检测mRNA表达，每个样本有3个平行复孔。

1.4 统计学分析

使用SPSS 24.0软件和GraphPad Prism 8软件对上述检测结果进行统计学分析。计量资料采用独立样本t检验，比较实验组与对照组间是否存在差异，α=0.05为检验水准，当P＜0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 影像学观察结果

X光片结果显示，实验组下颌第一磨牙根尖阴影增大，管壁增厚，形成一定数量的新的高密度硬组织，牙根仍发育。对照组大鼠下颌第一磨牙牙体完整，根尖周围未发现存在明显异常，牙根没有在系统发育过程中完成，根管口成喇叭状。

2.2 HE染色结果

HE染色结果显示，实验组大鼠下颌第一磨牙管腔及根管存在炎性细胞，牙根本质内壁上有新生硬组织生成，根尖有组织沉积，牙根长度增加，发生改变。根管内存在大量新生的组织，并且根尖有进一步闭合的趋势，牙根继续发育。对照组大鼠下颌第一磨牙管腔及根管不存在炎性细胞，牙髓为疏松结缔组织，位于牙本质组成的髓腔内，根尖呈现尚未完全闭合状态。

2.3 qRT-PCR检测结果

qRT-PCR检测结果显示，实验组VEGF的mRNA的表达比对照组高很多，差异有统计学意义（P=0.001 7＜0.05）；实验组NGF的mRNA的表达高于对照组，差异有统计学意义（P=0.039 7＜0.05）。如图1所示。

图1 qRT-PCR检测VEGF与NGF相对表达量结果示意图

3 讨论

近年来对血管内皮细胞生长因子（vascular endosthort growth factor，VEGF）的研究较多，它是1989年分离纯化出来的一类糖蛋白。是重要的血管源性生长因子，具有两大突出的生物学特性：一方面，它可显著增加血管通透性，是目前己知最强的血管通透性因子之一[7]。另一方面，它是一种强大的血管生成诱导剂，在炎症及创伤愈合过程中，可激活内皮细胞诱导新生血管形成[8]。有研究[9]显示VEGF在多种组织的损伤后修复过程中起作用。本实验中，血运重建术后大鼠牙髓根部的VEGF的qRT-PCR结果显示，VEGF的相对表达量显著高于对照组，且差异有统计学意义（P=0.001 7＜0.05）。结合影像学与组织学观察结果，提示牙髓血管通透性的增加和炎性细胞的积聚是由VEGF产物的上调引起的。该产品还可以增加牙髓血运重建过程中的血管内压力，加速炎症的发展。同时，VEGF产物可以保证了牙髓细胞组织血供充足，增加了患者血管通透性，益于组织进行修复。鉴于损伤愈合的2大典型特征：血管通透性增加和血管生成都因VEGF产物上调而出现，因此VEGF在牙髓血运重建过程中起到重要作用。

神经细胞生长因子（nerve growth factor，NGF）是一种多功能生长因子，促进中枢神经和周围神经的发育、分化和生长，其功能不断地被学者们深入探讨研究[10]。越来越多的学者通过研究NGF在不同的组织、器官（如大脑[11]、肝脏[12]、坐骨神经[13]、皮肤[14]等）中的作用发现，其与组织炎症的发生和损伤时伴发的痛觉过敏密切相关。本实验中，血运重建术后大鼠牙髓根部的NGF的qRT-PCR结果显示，NGF的相对表达量高于对照组，且差异有统计学意义（P=0.039 7＜0.05）。说明NGF参与牙髓血运重建的调控，在牙齿受到损伤或炎症感染后牙髓组织中NGF表达水平升高，牙髓局部NGF浓度的升高不仅可以促进牙髓损伤处感觉神经纤维再生，还可导致痛觉过敏的产生，刺激牙髓细胞分化为牙本质，促进矿化形成[15]；NGF本身也可促进牙髓细胞的增殖和向成牙本质细胞分化[16]。

综上所述，本实验通过建立大鼠下颌第一磨牙牙髓血运重建模型，利用影像学、组织学及qRT-PCR等方法对实验结果进行了评价，结果表明，在年轻恒牙牙髓血运重建过程中，其根部组织VEGF、NGF的mRNA相对表达量明显增加。