“金花”菌分离鉴定及其对茯茶化学成分的影响

冉莉莎 刘宝贵 陈崇俊 唐 倩 张 樟 朱洺志,3 傅冬和,3 王坤波,3

1（湖南农业大学茶学教育部重点实验室 长沙 410128）

2（湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心 长沙 410128）

3（湖南农业大学植物功能成分利用省部共建协同创新中心 长沙 410128）

4（中茶湖南安化第一茶厂有限公司 安化 413500）

核技术的快速发展、通讯工具的高度发达、以及环境的恶劣导致人们长期处于辐射状态下，辐射使人体产生过量的自由基，自由基引发一系列直接或间接效应损伤机体，严重危害人类健康［1］。茶叶里含有多种抗氧化活性及清除自由基能力的化合物，包括多酚、黄酮、多糖、糖苷等［2］。茯茶是一类特殊的微生物发酵茶，发酵过程中产生大量“金花”菌，“金花”菌能使茶叶中多酚类物质转化为具有更强的抗氧化活性以及清除自由基能力的茶色素类物质［3］。欧阳梅等［4］将“金花”菌接种至炒青绿毛茶上，使茶黄素及茶红素含量提高，清除自由基能力及抗氧化活性增强。许靖逸等［5］研究发现茶褐素对60Co γ辐射损伤小鼠有一定的防护作用。

“发花”是茯茶特有的加工工艺，通过控制一定的温湿条件，促使“金花”菌生长繁殖并成为优势微生物，最终在茯茶内部产生大量金黄色闭囊壳，俗称“金花”［6］。“金花”菌的多少是判断茯茶品质优劣的重要指标［7］。但到目前为止，“金花”菌的鉴定主要依靠形态学观察或ITS区序列比对分析，导致鉴定结果存在争议，出现“一菌多名”的现象［8］。彭晓赟等［9］通过形态观察将湖南茯砖茶中“金花”菌鉴定为冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。胡治远等［10］通过形态观察将湖南地区不同茯砖茶样中的“金花”菌鉴定为冠突散囊菌、谢瓦氏散囊菌（Eurotium chevalieri）、肋状散囊菌（Eurotium cortiforme）、蜡叶散囊菌（Eurotium herbariorum）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）。根据最新国际植物命名法规，散囊菌属（Eurotium）内菌种被移入曲霉属（Aspergillus）［11］。黄浩等［6］通过形态观察与ITS区序列对比分析将不同茶类中的“金花”菌鉴定为冠突散囊菌。吕嘉枥等［12］通过ITS区序列比对分析将陕西茯茶中“金花”菌鉴定为针刺曲霉（Aspergillus spiculosus）、阿 姆 斯 特 丹 曲 霉(Aspergillus amstelodami)、谢瓦曲霉(Aspergillus chevalieri)。最新研究表明，钙调蛋白基因（Calmodulin；caM）及RNA聚合酶II基因（RNA polymeraseⅡ；RPB2）可用于曲霉属（散囊菌属）真菌的区分和鉴定［11,13］。王磊等［14］通过多基因系统发育分析将湖南茯砖茶中分离的“金花”菌鉴定冠突曲霉。

本研究通过形态结构特征、ITS区序列比对分析和多基因系统发育分析等多种鉴定手段，对“金花”菌进行准确的分类鉴定。然后将该“金花”菌株接种至灭菌黑毛茶进行茯茶散茶快速“发花”，探究“金花”菌单菌对茯茶化学物质的影响。本研究可为茯茶品质形成机理提供相关依据，为“金花”菌的开发利用提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茯砖茶由中茶湖南安化第一茶厂有限公司提供。参照赵仁亮的方法［15］配制察氏培养基（CZ），包括20%察氏培养基（CZ20）、察氏酵母琼脂培养基（CYA）、麦芽汁琼脂培养基（MEA）和麦芽汁酵母琼脂培养基（M40Y）。

1.2 仪器与设备

Scope.A1显微镜，德国卡尔·蔡司股份有限公司；扫描电子显微镜，JSM-6380LV，日本电子株式会社；UV-2550紫外分光光度计，日本岛津。

1.3 方法

“金花”菌分离纯化、菌落形态观察、基因测序及系统发育进化树构建参照文献[14]实验方法，引物序列如表1所示。系统发育进化树的构建采用最大简约法（Maximum，MP），选择全部位点构建系统树，自展值（Bootstrap）1000次检验。

表1 PCR扩增引物序列Table1 Primers used for PCR amplification

茯茶散茶“发花”参照文献[6]实验方法进行，“发花”茯茶水浸出物含量测定参照（GB/T8305―2013）[16]；茶多酚总量测定参照国标（GB/T8313―2018）[17]；可溶性糖总量测定采用蒽酮硫酸法；黄酮总量测定采用三氯化铝比色法[6]；游离氨基酸总量测定参照（GB/T8314―2013）[18]。

1.4 数据处理

利用MEGA-X软件进行多基因进化树的构建，利用GraphPad Prism8.0进行相关图绘制。

2 结果与讨论

2.1 菌株的分离纯化及鉴定

2.1.1 不同培养基上菌落形态特征

图1为菌株ACF-1的形态特征观察，察氏培养基28℃培养7d（图1（a）），菌落直径20～22mm，呈近圆形；菌落中间紧密，有金黄色颗粒状闭囊壳，菌丝辐射状浅黄色至白色，干燥粗糙无渗出液，色素扩散至基质中，背面呈深褐色。37℃培养7d（图1（f）），菌落直径2～10mm，有橄榄绿分生孢子头，菌丝致密无光泽。20%察氏培养基上28℃培养7d（图1（b）），菌落直径25mm左右，其他形态与察氏培养基上基本相似。37℃培养7d（图1（g）），菌落直径25mm左右，菌落近圆形呈土黄色，未见闭囊壳，表面干燥粗糙无渗出液，色素扩散至基质中，背面呈深褐色。察氏酵母琼脂培养基28℃培养7d（图1（c）），菌落直径20～25mm，菌落中央菌丝致密呈土黄色，边缘浅黄偏白，未见闭囊壳，干燥粗糙无渗出液，色素扩散至基质。37℃培养7d（图1（h）），菌落直径10mm左右；菌落呈黄灰色至黄褐色，中央凹陷，褶皱状表面粗糙干燥，色素扩散至基质中，背面呈深褐色。麦芽汁琼脂培养基28℃培养7d（图1（d）），菌落直径25mm左右，菌落呈深黄色未见闭囊壳，表面干燥粗糙无渗出液，未见扩散色素。37℃培养7d（图1（i）），菌落直径5～10mm，菌落中间呈橙黄至红，凸起生长，表面干燥粗糙无渗出液，未见扩散色素。麦芽汁酵母琼脂培养基28℃培养7d（图1（e）），菌落直径40～50mm，菌落中心奶黄色边缘呈白色，菌丝较厚致密且絮状气生菌丝，表面干燥粗糙无渗出液，未见扩散色素。37℃培养7d（图1（j）），菌落直径40～45mm，菌落中央黄褐色，边缘金黄色。菌丝致密，干燥粗糙无渗出液，未见扩散色素。通过菌落形态特征分析，可初步判断ACF-1菌株为曲霉属内具有黄色闭囊壳的真菌菌株，但具体形态与王磊等［14］的研究有一定差异，而赵仁亮、王文涛等［15，23］研究发现同种不同来源的“金花”菌在形态特征上可能存在一定差异。

图1 菌株ACF-1的形态特征(a)～(e)依次为CZ、CZ20、CYA、MEA及M40Y培养基上的菌落特征(28℃，7d)；(f)～(j)依次为CZ、CZ20、CYA、MEA及M40Y培养基上的菌落特征(37℃，7d)；(k)为子囊果；(l)为发育中子囊果；(m)为破裂的子囊果；(n)为茯茶上闭囊壳；(o)为分生孢子头；(p)～(q)为分生孢子头及产孢结构；(r)为闭囊壳及其中子囊；(s)为子囊；(t)～(w)为子囊孢子Fig.1 Morphological characteristics of Aspergillus cristatus strain ACF-1.(a)～(e):colony on CZ,CZ20,CYA,MEA,and M40Y respectively(28°C,7d);(f)～(j)colony on CZ,CZ20,CYA,MEA,and M40Y,respectively(37°C,7d);(k):ascocarp;(l):developing ascocarp;(m):ruptured ascocarp;(n):conidia;(o):cleistothecium in Fu tea;(p)～(q):conidial heads;(r):a cleistothecium with asci(s):asco;(t)～(w):ascospore

2.1.2 光学显微结构特征

ACF-1在光学显微镜下子囊果呈球形或近球形（图1（k）），存在大量有隔菌丝，大量子囊果缠绕混生于菌丝中（图1（l））。子囊果里含大量子囊，在生长后期破裂释放子囊，子囊成熟后释放子囊孢子（图1（m））。分生孢子在菌株培养5d左右（培养初期）开始出现，分生孢子头成熟后呈辐射状，分生孢子梗光滑且较长（图1（o）～（p）），分生孢子瓶梗位于顶囊上，顶囊近似球形，孢子小梗单层，分生孢子串生，分生孢子呈椭球形或球形（图1（q））。根据光学显微结构特征，这与黄浩［6］的研究结果吻合，可初步断定ACF-1菌株为曲霉属真菌。已有研究表明冠突曲霉与谢瓦氏曲霉、肋状曲霉形态特征十分相似，这几种真菌均能产生黄色的闭囊壳［11］。冠突曲霉与谢瓦氏曲霉的差别仅在于后者子囊孢子凸面光滑，但这可能与冠突曲霉子囊孢子发育成熟度有关［9］。

2.1.3 电子显微结构特征

扫描电镜观察发现，ACF-1菌株的子囊果成熟后逐渐破裂（图1（r）），释放子囊。子囊近球形，大小10μm左右，每个子囊含有8个子囊孢子（图1（s））。子囊破裂释放子囊孢子，子囊孢子大小（4～5）μm×（5～6）μm。子囊孢子双凸镜状，表面粗糙，具有疣状突起，“赤道”部分有两道明显的鸡冠状突起（图1（t）～（w））。ACF-1菌株的子囊孢子电子显微镜结构特征，与前人对冠突曲霉的子囊孢子的描述一致［6］。因此，可初步断定ACF-1菌株为冠突曲霉。虽然子囊孢子对曲霉属内物种的分类鉴定有一定作用，但真菌形态特征与环境有关，也与发育成熟度有关［9］，仅凭形态特征无法进行准确的鉴定，有必要结合其他手段进行进一步鉴定。

2.1.4 ITS序列比对分析和多基因系统发育进化分析

将ACF-1菌株ITS区序列在NCBI数据库进行比对，结果显示该菌ITS区序列与针刺曲霉、阿姆斯特丹曲霉、谢瓦曲霉具有99%以上同源性。这与吕嘉枥等［12］研究结果一致。赵仁亮等［15］研究发现仅通过形态学及ITS区来鉴定曲霉属曲霉组内物种可能出现错误的结果。因此ACF-1菌株的ITS区序列比对结果只能确定该菌属于曲霉属真菌（散囊菌属），但无法在种水平上进行准确鉴定，需要进一步测定其他基因位点，再结合ITS区序列比对结果与形态特征观察进行鉴定。对ACF-1菌株的β-tubulin、caM、RPB2基因序列进行测序分析，然后将ACF-1菌株β-tubulin、caM、RPB2基因序列测序结果分别与曲霉属曲霉组内（散囊菌属）标准菌株的相应序列进行Clusta W比对，然后将比对结果合并后构建多基因系统发育树。结果如图2所示。ACF-1菌株与冠突曲霉标准菌株NRRL4222聚为一支，且自展支持率为100%。这与王磊等［14］对湖南茯茶中“金花”菌的多基因系统发育进化结果一致。

图2 基于β-tubulin、caM、RPB2基因最大似然法构建的系统发育树（树分支上的值为自展支持率）Fig.2 A phylogenetic tree constructed based on the maximum likelihood method of β-tubulin,caM,and RPB2genes(Value on the tree branch is the self-expanding support rate)

因此，综合菌落形态特征、光学显微结构特征、扫描显微结构特征、ITS区序列比对、以及基于β-tubulin、caM、RPB2基因序列的多基因系统发育进化树分析，最终将ACF-1鉴定为冠突曲霉菌。

2.2 散茶“发花”及其对茯茶主要化学物质的影响

黑毛茶是生产茯茶的原料［15］。本研究首先对黑毛茶进行高温灭菌处理，然后将ACF-1菌株接种到灭菌的黑毛茶作为处理组（ACF-1组），以不接种ACF-1菌株的灭菌黑毛茶作为对照组（CK组），进行快速散茶“发花”实验。图3为两种不同处理散茶“发花”茶样观察，处理组接种的ACF-1菌仅4d后在灭菌黑毛茶表面大量繁殖，肉眼可见大量金黄色颗粒，达到散茶“发花”对金花颗粒数量的要求（图3（a））；而对照组的黑毛茶表面未有肉眼可见的微生物生长（图3（b））。已有研究表明，目前茯茶散茶“发花”一般需要10d以上［6］，而本研究仅4d即可实现茯茶散茶“发花”。因此，本研究实现了快速散茶“发花”，从而有助于缩短生产周期，节约生产成本。

图3 散茶“发花”茶样：（a）接种ACF-1菌茶样；（b）未接种ACF-1菌茶样Fig.3 “flowering”tea samples of loose tea:(a)tea samples inoculated with ACF-1fungus;(b)tea samples not inoculated with ACF-1fungus

为了探究“发花”对茯茶主要化学品质的影响，将菌株ACF-1菌株接种至黑毛茶进行“发花”处理，在“发花”结束后测定主要化学成分的变化，如图4所示，与CK组相比，ACF-1组的茶多酚含量下降11.3%。造成这种变化的原因可能是“发花”过程中冠突曲霉菌分泌出多种氧化酶类将茶多酚转化为茶红素、茶褐素等色素类物质，从而使茶汤橙红明亮［24］；同时由于湿热作用等非酶促作用一直在进行，使茶多酚发生异构、降解等反应，使茶汤口感醇和、减少苦涩滋味［25］。与CK组相比，ACF-1组水浸出物含量增2.55%，游离氨基酸总量下降17.3%，可溶性糖含量下降11.9%，黄酮含量下降了33.8%。这可能是因为冠突曲霉分泌的胞外酶将茶叶中的大分子物质分解为多种小分子水溶性物质，从而使茶叶水浸出物含量增加。微生物利用氨基酸进行生长繁殖，造成氨基酸含量下降。微生物发酵消耗可溶性糖，同时湿热条件下糖类物质可与氨基酸等发生反应形成香气等成分，导致可溶性糖含量下降［24］。黄酮可能在湿热和酶的作用下发生水解等反应；同时咖啡碱也会与黄酮类物质发生反应形成新的络合物，改善茶汤的滋味［25］。在散茶“发花”实验中，与CK组相比，ACF-1组的水浸出物含量略微增加，而茶多酚、黄酮、可溶性糖、游离氨基酸含量都不同下降，这与黄浩［6］的研究结果基本吻合。

图4 ACF-1菌株散茶“发花”对黑毛茶主要化学成分的影响（**p＜0.01，*p＜0.05，与CK组相比）Fig.4 Influence of ACF-1strain artificial loose tea“flowering”on the main chemical components of primary dark tea(**p＜0.01,*p＜0.05,compared with CK group)

3 结论

本研究从湖南茯砖茶中分离出一株“金花”菌，通过菌落形态特征、光学显微结构特征、扫描显微结构特征、ITS区序列比对、以及基于βtubulin、CaM、RPB2基因序列的多基因系统发育进化树分析，最终将该“金花”菌鉴定为冠突曲霉菌。采用该冠突曲霉菌进行茯茶散茶“发花”，实现了茯茶散茶快速“发花”；并发现冠突曲霉菌“发花”使茶叶水浸出物含量上升，茶多酚、可溶性糖、黄酮、游离氨基酸总量下降。本研究可为茯茶品质形成机理提供相关依据，为“金花”菌的开发利用提供指导。