黑龙江省马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）群体动态分析

张铉哲，任雪琦，赵 雪，徐浩然，陈苏慧，周子豪

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

我国是马铃薯生产大国，种植面积和产量均较高[1]。黑龙江省因其独有冷凉气候条件及纬度条件适于马铃薯生产，为我国马铃薯主要种植地区之一[2]。马铃薯晚疫病是影响马铃薯产量严重病害之一[3]，危害程度和防治难度较大，是一种爆发急、可循环发生的毁灭性病害[4]。马铃薯晚疫病菌群体动态分析与病害发生和流行关系密切，可为马铃薯晚疫病防治提供重要理论依据。因此，马铃薯晚疫病菌群体动态分析成为研究人员关注重点。简单重复序列标记（Simple sequence repeats，SSR），也称为微卫星标记（Microsatellite），将片段扩增后产物通过聚丙烯凝胶酰胺电泳分析多态性。近年来SSR标记被广泛应用于遗传育种、种属鉴定、遗传变异等研究领域。Arafa等利用12对引物对采自埃及的40株马铃薯晚疫病菌测定SSR基因型，共检测出SSR基因型有7种[5]。王腾于2010～2013年采集黑龙江省71株马铃薯晚疫病菌中发现，黑龙江地区菌株遗传相似系数范围有逐年增加趋势，且亲缘关系与采集地点之间相关性不明显[6]。

本研究旨在测定2019～2020年黑龙江省部分地区马铃薯晚疫病菌表现型（瑞毒霉敏感性、交配型）和基因型（mtDNA单倍型、SSR基因型）。通过明确黑龙江省马铃薯晚疫病菌表现型和基因型，掌握晚疫病菌群体结构动态变化，以期在马铃薯生产过程中监测晚疫病发生，并为其有效防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试马铃薯晚疫病菌

2019～2020年，在黑龙江省马铃薯产区：哈尔滨市[呼兰区（HL）、香坊区（XF）、宾县（BX）]，齐齐哈尔市[克山县（KS）、依安县（YA）]，绥化市[北林区（BL）、望奎县（WK）、青冈县（QG）]，双鸭山市[宝清县（BQ）]，鸡西市[虎林市（HL）]，牡丹江市[东安区（DA）]等地区采集菌株。其中克山县（KS）23株、依安县（YA）15株、香坊区（DN）77株、呼兰区（HL）11株、北林区（SH）18株、望奎县（WK）9株、东安区（MDJ）31株，虎林市（HL）25株、宾县（BX）16株、宝清县（BQ）21株、青冈县（QG）16株。

马铃薯A1、A2交配型标准菌株由东北农业大学农学院病理研究室提供。

1.1.2 供试培养基

1 L 20%番茄汁琼脂培养基：800 mL蒸馏水、200 mL番茄汁、20 g琼脂、4.5 g碳酸钙。

1 L选择性培养基：0.5 g氨苄青霉素、0.05 g利福平、0.2 g万古霉素、0.1 g匹马霉素、0.035 g五氯硝基苯、0.01 g苯菌灵。

1.2 方法

1.2.1 马铃薯晚疫病菌交配型测定

1.2.1.1 对峙培养法测定交配型

采用皿内对峙法测定交配型。将待测菌株与标准交配型菌株对峙培养，以待测菌株单独培养为对照，置于21℃培养15～21 d后，显微镜观察菌落交界处是否产生卵孢子，如待测菌株仅与A2交配型菌株对峙培养时产生卵孢子,则该菌株为A1交配型；反之，仅与A1交配型菌株对峙培养时产生卵孢子则为A2交配型；如果待测菌株单独培养时即产生卵孢子,则为自育型菌株，试验设置3次重复。

1.2.1.2 马铃薯晚疫病菌DNA提取

收集在番茄汁培养基中培养20～25 d菌丝体于研钵中,加液氮研磨成粉末状后,采用植物DNA提取试剂盒提取菌丝基因组DNA（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.2.1.3 分子标记法测定交配型

参考Brylińska等PCR-RFLP方法分析交配型[7]。

1.2.2 马铃薯晚疫病菌甲霜灵抗药性测定

通过生长速率法测定晚疫病菌对甲霜灵抗药性。取直径为7 mm待测菌株菌饼接种到0、5、10、100 mg·L-1浓度梯度甲霜灵的番茄汁培养基平板上，将其在21℃、黑暗条件下培养7 d，采用十字交叉法测定各处理菌落直径，设置3次重复。甲霜灵敏感性划分标准如下：敏感菌株（S），含甲霜灵5、100 mg·L-1平板菌落直径≤40%对照菌落直径；中抗菌株（MR），含甲霜灵5 mg·L-1平板菌落直径≥40%对照菌落直径且100 mg·L-1平板菌落直径≤40%对照菌落直径；高抗菌株（HR），含甲霜灵5、100 mg·L-1平板菌落直径≥40%对照菌落直径。

1.2.3 马铃薯晚疫病菌线粒体DNA单倍型测定

1.2.3.1 马铃薯晚疫病菌DNA提取

DNA提取同1.2.1.2。

1.2.3.2 线粒体DNA单倍型测定方法

参考Shaw和Griffith[8]的PCR-RFLP方法测定线粒体DNA单倍型，扩增产物通过1.0%琼脂糖凝胶检测，划分标准参考Griffith等方法可将马铃薯晚疫病菌线粒体DNA单倍型划分为4种类型[8],即Ⅰa、Ⅱa、Ⅰb和Ⅱb型。

1.2.4 马铃薯晚疫病菌SSR基因型测定

1.2.4.1 SSR引物序列及方法

参考Knapova等[9]测定马铃薯晚疫病菌SSR基因型。试验采用11对引物，即Pi4B、Pi4G、G11、Pi63、Pi70、SSR2、SSR3、SSR4、SSR6、SSR8、SSR11。具体引物序列见表1。

表1 SSR基因型测定所用引物序列Table 1 Primer sequence for detection of SSR genotype

参考王晨[10]方法利用以上11对SSR引物扩增。

反应体系（25μL）：DNA模板0.5μL，F-Primer 1μL，R-Primer 1μL，2×PCR Master Mix 13μL，ddH2O 9.5μL。

扩增程序：94℃预变性3 min，此后35个循环，每个循环94℃变性35 s，57℃退火40 s，72℃延伸20 s，最终72℃延伸8 min。向4μL PCR样品中加入2μL的6×Loading Buffer混合，将其置于95℃条件下变性10 min，将变性后样品经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染，凝胶在灯箱下观察拍照以供分析。

1.2.4.2 扩增条带统计与分析

统计扩增条带结果，出现条带记为1，未出现条带则记为0，建立原始数据矩阵后，使用NTSYSpc（version 2.1）（Exeter Software，Setauket，NY）和Population geneticanalysis1.3.2软件分析数据。

2 结果与分析

2.1 马铃薯晚疫病菌交配型、甲霜灵抗性及mtDNA单倍型测定

2.1.1 马铃薯晚疫病菌交配型测定

在2019～2020年，于黑龙江省马铃薯产区采集并分离262个菌株，对所有菌株测定交配型。结果见表2，A1交配型菌株占81.3%，A2交配型菌株占11.1%，SF型菌株占7.6%，在黑龙江省各马铃薯产区A1和A2交配型菌株可发生有性生殖。

表2 2019～2020年马铃薯晚疫病菌交配型分析Table 2 Analysis of mating type of Phytophthora infestans from 2019 to 2020

2.1.2 马铃薯晚疫病菌甲霜灵抗性及mtDNA单倍型测定

结果见表3。

表3 2019～2020年马铃薯晚疫病菌甲霜灵抗性及mtDNA单倍型分析Table 3 Analysis of metalaxyl resistance and mtDNA haplotype of potato late blight from 2019 to 2020

在甲霜灵抗性检测中，55%菌株为高抗性菌株，27.1%菌株为中抗性菌株，17.9%菌株为敏感性菌株。在mtDNA单倍型检测中，共检测出两种线粒体单倍型，其中24株（9.2%）为Ia型，238株（90.8%）为IIa型。

2.2 马铃薯晚疫病菌SSR基因型分析

2.2.1 部分引物PCR扩增琼脂糖凝胶电泳检测

利用11对引物对供试菌株DNA作PCR扩增，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，所有扩增结果均检测到目的条带且条带清晰。部分菌株及部分产物检测结果如下图所示（见图1）。

图1 部分菌株的部分引物琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 Agarose gel electrophoresis of some strains with partial primers

2.2.2 SSR聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及多态性分析

将经11对引物PCR扩增产物变性后用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，部分菌株及部分产物检测结果如图2所示。

图2 部分菌株聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱Fig.2 Polyacrylamide gel electrophoresis of some strains

对262株马铃薯晚疫病菌11对引物等位基因和Nei′s基因多样性分析结果显示（见表4），通过比较所有等位基因Nei′s基因多样性发现，SSR2的Nei′s基因多样性为0.4985，比其他等位基因Nei′s基因多样性均高，说明在所测菌株中，SSR2产生多样性比其他10对等位基因高。在11对等位基因中，SSR3的Nei′s基因多样性最低，为0.1262，而11对等位基因平均Nei′s基因多样性为0.2734。由此可见，SSR3等位基因基因多样性指数较低。

表4 马铃薯晚疫病菌群体中11对引物等位基因频率及多样性Table 4 Frequency and diversity of allele in Phytophthora infestans population identificated by using 11 primer pairs

2.2.3基因型分析

利用11对引物对262株马铃薯晚疫病菌标记，共检测出39种基因型，编号为H-1～H-39。在所检测出的基因型中，优势基因型为H-11，基因型频率为18.32%，其次为H-28，基因型频率为13.74%（见表5）。

表5 马铃薯晚疫病菌基因型及基因型频率Table 5 Genotype and genotype frequency of Phytophthora infestans isolates in different location of Heilongjiang Province

从采集年份看，2019年共检测出28种基因型，2020年共检测出35种基因型，基因型H-9、H-18、H-26、H-27为2019年所特有基因型，基因型H-29～H-39为2020年所特有基因型。从采集地点看，望奎县基因型频率为77.78%，基因型复杂度最高，哈尔滨市香坊区基因型频率为29.87%，基因型复杂度最低，各市县基因型存在差异。

2.2.4聚类分析

根据SSR分析结果，应用R stdio软件对39个不同基因型马铃薯晚疫病菌作UPGMA聚类分析（见图3～4）。利用11对引物将2019年黑龙江省各马铃薯主产区采集的137株马铃薯晚疫病菌划分为28个基因型。当遗传相似系数为0.82时，将所测菌株分为3个聚类组，其中第一个聚类组共有40个菌株，占29.2%；第二个聚类组共有35菌株，占25.5%；第三个聚类组共有62个菌株，占45.3%。利用11对引物将2020年采集的125株马铃薯晚疫病菌划分为35个基因型。当遗传相似系数为0.82时，将所测菌株分为3个聚类组，其中第一个聚类组共有68个菌株，占54.4%；第二个聚类组共有56个菌株，占44.8%；第三个聚类组仅有1个菌株，占0.8%。由图3、4可见，所测菌株被区分出来的3个聚类组里，每个聚类组所包含菌株采集地点存在区别，但总体上无明显划分趋势。因此，马铃薯晚疫病菌聚类组与采集地点无相关性。

图3 2019年黑龙江省部分地区马铃薯晚疫病菌聚类图Fig.3 Dendrogram of Phytophthora infestans in part of Heilongjiang Province in 2019

从采集年份看，2020年所检测SSR基因型较2019年更复杂，且2019～2020年均有新基因型出现。因此，黑龙江省马铃薯产区采集的马铃薯晚疫病菌聚类组与采集时间存在相关性，不同年份间聚类组存在差异。

2.2.5 遗传多样性分析

应用Population genetic analysis 1.3.2数据分析软件分析262个马铃薯晚疫病菌菌株遗传多样性，分析结果见表6。黑龙江省各马铃薯产区马铃薯晚疫病菌群体na（等位基因数）、ne（有效等位基因数）、h（基因多样度）、I（Shannon指数）如表6所示。

表6 黑龙江省部分地区马铃薯晚疫病菌群体遗传多样性Table 6 Genetic diversity of Phytophthora infestans populations in different regions of Heilongjiang Province

根据地点划分后，各项多样性参数出现差异。其中，有效等位基因数、基因多样度、Shannon指数以虎林市最高（ne=1.5364；h=0.3094；I=0.4651），望奎县最低（ne=1.3950；h=0.2288；I=0.3399）。等位基因数以虎林市最高（na=1.9231），依安县最低（na=1.6254）。群体多态性位点为28，多态性百分比为72.01%，其中虎林市多态性最高，百分比为92.31%；依安县多态性最低，百分比为61.54%。

图4 2020年黑龙江省部分地区马铃薯晚疫病菌聚类图Fig.4 Dendrogram of Phytophthora infestans in part of Heilongjiang Province in 2020

3 讨论与结论

本试验对2019～2020年采集自黑龙江省部分马铃薯产区马铃薯晚疫病菌开展分离与培养，并测定交配型、甲霜灵抗性和线粒体单倍型。发现在近两年中A1交配型菌株呈先增后减趋势，但在2019～2020年A1交配型菌株占比最高，与沙海天等研究结果一致[11]，关于A1交配型菌株优势菌株地位是否发生变化仍需深入研究。甲霜灵敏感性菌株有逐年增加趋势，说明黑龙江省各地区晚疫病菌对甲霜灵抗药性逐年下降，与孙秀梅等研究结果相反[12]，可能与近年来黑龙江省减少甲霜灵药剂使用，其他类型药剂防治马铃薯晚疫病有关。目前，黑龙江省马铃薯晚疫病菌优势线粒体单倍型为IIa型，同时近年来线粒体单倍型变化情况复杂，表明晚疫病菌群体结构发生变化，因此关于马铃薯晚疫病菌遗传变异规律仍需深入研究。

在国内外研究中，通常利用多种不同引物对马铃薯晚疫病菌作SSR基因型分析。王佳楠利用29对引物分析黑龙江省采集的103株马铃薯晚疫病菌遗传多样性，结果显示21对引物可表现出多态性，表明黑龙江省马铃薯晚疫病菌遗传多样性较丰富[13]。王鹤利用6对引物测定采自黑龙江省和吉林省SF型马铃薯晚疫病菌SSR基因型，结果发现，所测SF型菌株中菌株基因型较为单一[14]。姚国胜等在黑龙江省采集的17株马铃薯晚疫病菌发现F-01和G-01两种基因型，其中F-01占比更高，且其与国外菌株亲缘关系较远[15]。

本试验利用11对引物对2019～2020年采集自黑龙江省马铃薯产区的262株马铃薯晚疫病菌作SSR基因型分析，11对引物均表现出多态性，共鉴定出39种基因型，H-11为优势基因型，基因型频率为18.32%。从采集年份上看，2019年共检测出28种基因型，2020年检测出35种基因型，基因型H-9、H-18、H-26、H-27为2019年所特有基因型，基因型H-29～H-39为2020年所特有基因型，且在不同年份之间存在差异。从采集地点上看，与其他几个地区相比，望奎县基因型复杂度最高，在所采集的9个菌株中发现7种基因型，同年份各个地区之间基因型分布存在差异，与上述研究结果一致。研究表明黑龙江省晚疫病菌遗传多样性较丰富，与王佳楠等研究结果一致[13]。综上所述，马铃薯晚疫病表现性和基因型有逐年复杂化趋势，可能是有性生殖基因重组所致，具体原因需进一步探究。