过表达性别决定区Y框蛋白7基因对骨肉瘤细胞生长及免疫逃逸相关因子表达的影响

于云祥 龚泰芳 刘小涛 柯文 李彬彬 廉凯 徐进△

骨肉瘤是常见的原发性恶性骨肿瘤，恶性程度高，预后差，5年生存率低[1]。近年分子靶向治疗成为肿瘤治疗研究热点。尽管骨肉瘤治疗方法已不断更新，但是治疗效果却不甚理想，寻找有效的治疗方法具有重要的意义。SOX7是含高迁移率组蛋白(HMG)结构域的SOX基因家族SOXF亚组成员之一，在癌症中低表达，对肿瘤发生发展具有重要作用[2-4]。有研究表明miR-664能通过靶向抑制SOX7增强骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力[5]。Wnt/β-catenin信号通路是比较经典的信号转导途径，与肿瘤发展密切相关，如下调RIPK4可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制骨肉瘤细胞增殖[6]。但SOX7与骨肉瘤细胞凋亡、免疫反应及其可能相关的Wnt/β-catenin信号通路的关系还未明确。鉴于此，本研究通过建立重组体pcDNA3.1-SOX7，旨在探讨过表达SOX7对骨肉瘤细胞生长、周期、凋亡、免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表达及Wnt/β-catenin信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

RPMI-1640培养基、CCK-8试剂盒均购自美国Sigma；FBS购自美国Gibco；pcDNA3.1载体及Lipofectamine 2000试剂盒均购自Invitrogen 公司；SOX7、β-catenin、cyclinD1、survivin、VEGF和TGF-β1抗体及HRP标记的二抗均购自美国CST；细胞凋亡试剂盒、流式细胞仪均购自美国BD；酶标仪及凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人骨肉瘤MG-63细胞株购自中国科学院上海细胞库。细胞用RPMI-1640培养基(含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素及10% FBS)，在5%CO2、37 ℃恒温、饱和湿度条件下传代培养。细胞生长状态良好时用于实验。每2～3 d换液1次，依据细胞密度传代。

1.2.2细胞转染 转染前24 h调整MG-63细胞密度，以2 mL/孔(5×105/mL)接种于6孔板。分为重组pcDNA3.1-SOX7组、pcDNA3.1组和空白组。无双抗的完全培养基培养MG-63细胞24 h，使转染时细胞达90%～95%的细胞密度。无血清培养基冲洗6孔板内细胞两遍，加2 mL无血清培养基。无血清培养基分别稀释pcDNA3.1-SOX7、pcDNA3.1及Lipofectamine 2000，轻摇混匀。将稀释好的pcDNA3.1-SOX7和pcDNA3.1分别与Lipofectamine 2000混合，室温孵育20 min，加入6孔板相应的孔内，在5%CO2、37 ℃恒温、饱和湿度培养箱中孵育6 h，更换为含血清的完全培养基。48 h后通过Western Blot检测转染效果。

1.2.3Western Blot检测 收集转染pcDNA3.1-SOX7和pcDNA3.1 48 h的MG-63细胞，加入适量RIPA裂解液，在冰上反应30 min，离心，收集上清。BCA试剂盒测定上清蛋白浓度。蛋白与上样缓冲液混匀，煮沸变性5 min。取40 μg变性蛋白上样，经SDS-PAGE、半干法转NC膜及5%脱脂奶粉封闭膜后，洗膜，加稀释后的SOX7、β-catenin、CyclinD1、Survivin、VEGF和TGF-β1抗体(稀释比例1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜，加1∶3 000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，37 ℃摇床震荡1 h，洗膜，ECL显色。Quantity One软件进行灰度值分析。蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。实验重复3次。

1.2.4CCK-8法检测细胞活力 取生长至对数期的MG-63细胞，以5×103/孔接种于96孔板，参照前述方法转染pcDNA3.1-SOX7和pcDNA3.1，并设置空白组，在培养的24，48和72 h收集上述3组细胞，在每孔中加入10 μL CCK-8试剂，继续孵育4 h，450 nm吸光度酶标仪测定各孔的吸光度值(A)。以A值绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

1.2.5流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率 按照前述方法转染pcDNA3.1-SOX7后48 h，收集细胞，将细胞制备成单细胞悬液，计数1×106个细胞，常规固定处理，PI染色，筛网过滤细胞悬液后，使用流式细胞仪检测各组细胞周期分布。同样方法收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒说明书染色，避光室温放置15 min，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。实验重复3次。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 pcDNA3.1-SOX7转染MG-63细胞效率

pcDNA3.1-SOX7转染MG-63细胞48 h，通过Western Blot检测转染效果，结果如图1和表1所示，转染重组体pcDNA3.1-SOX7后，MG-63细胞SOX7表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而转染pcDNA3.1空载体组SOX7表达与空白组差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 pcDNA3.1-SOX7转染MG-63细胞后SOX7的蛋白相对表达量

图1 pcDNA3.1-SOX7转染MG-63细胞后SOX7蛋白表达

2.2 过表达SOX7抑制MG-63细胞活力

如表2所示，pcDNA3.1-SOX7转染MG-63细胞24，48和72 h，细胞活力均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而pcDNA3.1组在3个时间点的细胞活力与空白组差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 转染pcDNA3.1-SOX7的MG-63细胞活力

2.3 过表达SOX7阻滞MG-63细胞周期

如表3所示，与空白组比较，pcDNA3.1-SOX7组G0/G1期细胞百分比升高，G2/M期和S期细胞百分比降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，不同组间、不同时间点间、组间×时间交互作用下的过表达SOX7阻滞MG-63细胞周期差异均有统计学意义(P<0.05)，说明细胞发生G0/G1期阻滞。

表3 过表达SOX7对MG-63细胞周期的影响

2.4 过表达SOX7诱导MG-63细胞凋亡

如图2和表4所示，pcDNA3.1-SOX7转染MG-63细胞48 h，细胞凋亡率明显高于空白组(P<0.05)。

图2 过表达SOX7对MG-63细胞凋亡的影响

表4 过表达SOX7后的各组MG-63细胞凋亡率

2.5 过表达SOX7抑制MG-63细胞VEGF和TGF-β1表达

通过Western Blot检测转染pcDNA3.1-SOX7的MG-63细胞免疫抑制相关因子VEGF和TGF-β1表达，结果如图3和表5所示，pcDNA3.1-SOX7组VEGF和TGF-β1蛋白表达均明显低于空白组(P<0.05)。

表5 过表达SOX7的MG-63细胞VEGF和TGF-β1蛋白相对表达量

图3 过表达SOX7对MG-63细胞VEGF和TGF-β1表达的影响

2.6 过表达SOX7抑制MG-63细胞Wnt/β-catenin信号通路

通过Western Blot检测转染pcDNA3.1-SOX7的MG-63细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、CyclinD1和Survivin表达，结果如图4和表6所示，pcDNA3.1-SOX7组β-catenin、CyclinD1和Survivin蛋白表达均明显低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 过表达SOX7对MG-63细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

表6 过表达SOX7的MG-63细胞β-catenin、CyclinD1和Survivin的蛋白相对表达量

3 讨论

SOX7是SOX基因家族SOXF亚组成员之一，近年来的研究表明SOX7在结直肠癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤中呈现低表达或不表达，其表达降低可促进肿瘤细胞生长[7-9]，这提示在肿瘤发生发展中SOX7可能充当抑癌基因样作用。骨肉瘤中关于SOX7的研究较少，有研究显示SOX7是miR-664的一个靶基因，miR-664可通过靶向抑制SOX7增强骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力[5]。SOX7是否可影响骨肉瘤细胞凋亡、周期等生物学特性还未明确。本研究结果显示过表达SOX7的人骨肉瘤MG-63细胞SOX7表达明显升高，细胞活力明显降低，细胞发生G0/G1期阻滞，细胞凋亡率明显升高，提示SOX7同样可影响骨肉瘤细胞生长，可能是骨肉瘤诊疗的一个分子标记。

Wnt/β-catenin信号通路是Wnt信号的经典信号途径，人类多种肿瘤可发现Wnt/β-catenin信号通路的异常表达，如肝癌、乳腺癌、骨肉瘤等[10-13]。多项研究表明SOX7可通过调控胶质瘤、子宫内膜癌等肿瘤Wnt/β-catenin信号而抑制肿瘤细胞生长[14-15]。已有研究证实SOX7是Wnt/β-catenin/TCF信号的抑制因子，可通过与TCF竞争与β-catenin结合，从而发挥肿瘤抑制基因功能[6]。SOX7对骨肉瘤细胞生长影响是否与Wnt/β-catenin信号通路有关还未明确。本研究将过表达SOX7载体转染MG-63细胞，通过Western Blot检测Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-catenin及下游与肿瘤发生密切相对的靶基因cyclinD1和Survivin表达，结果显示过表达SOX7可明显下调β-catenin、cyclinD1和Survivin表达，提示SOX7对骨肉瘤细胞活力、周期及凋亡影响机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关，这也与前人在其他肿瘤中的研究结果一致。

转化生长因子β1(TGF-β1)是一种多功能的蛋白多肽，是目前已发现的肿瘤诱导产生的最强的免疫抑制因子，TGF-β1过表达的肿瘤细胞侵袭能力更强，且预后不良[16-17]。已有研究表明TGF-β1可诱导多种肿瘤细胞生长[18]，血管内皮生长因子(VEGF)可由大多数肿瘤细胞产生，对肿瘤血管生成有促进作用。多种肿瘤中VEGF呈现高表达，其表达与患者预后不良及无瘤生存期密切相关[19]。有研究表明抑制Wnt/β-catenin信号通路可明显降低VEGF表达[20]，SOX7是否可影响TGF-β1和VEGF表达还未明确。本研究结果显示过表达SOX7可明显下调TGF-β1和VEGF表达，提示SOX7抑制骨肉瘤细胞生长机制之一可能是降低免疫逃逸。

综上所述，本研究将过表达SOX7的载体转染骨肉瘤MG-63细胞，通过CCK-8法、流式细胞仪、Western Blot分别检测过表达SOX7后的MG-63细胞活力、周期、凋亡及免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表达及Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、cyclinD1和Survivin表达，发现过表达SOX7可明显抑制MG-63细胞活力，阻滞细胞于G0/G1期，并诱导细胞凋亡，下调TGF-β1和VEGF及Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、cyclinD1和Survivin表达，提示SOX7可能是骨肉瘤分子诊疗靶点之一，但目前SOX7对骨肉瘤的影响及其机制研究较少，还需进一步深入研究。