壮药穿根藤质量标准研究

洪影雯，谢泽碧，梁子宁

（1.广西中医药大学药学院，南宁 530001；2.广西梧州制药（集团）股份有限公司，广西 梧州 543000）

穿根藤为茜草科九节属植物蔓九节（Psychotria serpensL.）的干燥全株，又名匍匐九节、伸筋藤、石邦子、上木蛇、风不动藤等［1-3］，是广西壮族民间常用草药。主要分布于广西、广东、福建、浙江、台湾和海南等省区［1，2］，广西多分布于上思、防城、玉林、北流、博白、柳州、苍梧等地［3］。该品性平，味苦、辛，归肝经［1，2］。具有祛风除湿、舒经活络、消肿止痛等功效，主要治疗风湿关节痛、手足麻木、腰肌劳损、坐骨神经痛、多发性痈肿、骨结核、跌打损伤、骨折、毒蛇咬伤等［1-3］。在民间有较长的使用历史，始载于《广西本草》《中国壮药资源名录》，但《中国药典》及《广西中药材标准》尚无收载。蔓九节中主要含有环烯醚萜苷类、三萜类、甾醇类以及大量黄酮类及其他类成分［4-7］。通过查阅文献，发现对蔓九节的研究较少，主要集中在性状［8，9］、显微［10］及DNA 分子方面的研究［11，12］，尚未见有关质量标准方面的报道。在前期的研究中发现，蔓九节中含有车叶草苷成分，依据相关文献［13-15］，确定了车叶草苷的含量测定方法。为确保其临床用药的安全性和有效性，通过鉴别研究、常规检查、浸出物及车叶草苷含量测定，为其质量标准的建立提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

车叶草苷对照品，上海士锋生物科技有限公司，批号18032716；穿根藤药材分别采于广西壮族自治区内不同产地，共15 个批次，经广西中医药大学药用植物教研室梁子宁教授鉴定其为茜草科植物蔓九节的全株，来源见表1。所用试剂均为分析纯。

表1 穿根藤来源信息

ZF-20C 型暗箱三用紫外分析仪，上海精密仪器仪表有限公司；尼康生物显微镜Eclipse E200MV，南京横桥仪器有限公司；1260 系列高效液相色谱仪，包括G-1311C 高压四元泵，二极管阵列检测器，1260 series 色谱工作站，美国安捷伦科技公司。

1.2 鉴别

1.2.1 药材性状鉴别 主根不明显。干燥茎呈圆柱形，有许多不定根，周皮青褐色至深棕色，具细纵纹，质硬，易折断，断面米黄色。干燥叶多皱缩，对生，全缘，稍反卷，展平后呈卵形或椭圆形，长1~3 cm，宽0.8~2.5 cm；先端渐尖或急尖，基部楔形，叶面暗绿色，背面叶黄绿至灰绿色，叶稍革质。果实为核果，扁球形（图1）。

图1 穿根藤药材

1.2.2 根横切面显微鉴别 类圆形。最外为2~3 层木栓层细胞，排列紧密。木栓形成层不明显。栓内层与皮层9~10 层细胞，占根的横切面约1/4，分界不明显，细胞圆形或类圆形，其内侧胞腔较大的细胞中含针晶束且断续成环。内皮层不明显。维管束为无限外韧型。韧皮部由筛管、伴胞、韧皮纤维和韧皮薄壁细胞组成，韧皮部占横切面比例较少。形成层不明显。木质部由薄壁细胞、导管和纤维组成，占根横切面1/2 以上，导管散在、口径较大。维管射线明显。无髓部（图2）。

图2 穿根藤根横切

1.2.3 茎横切面显微 类圆形。表皮角质化明显，为一列排列整齐的类方形细胞，具非腺毛。皮层为类圆形的薄壁细胞，皮层内侧部分细胞中含有较多的草酸钙针晶束。维管束为无限外韧型，其外侧有1~2 层石细胞群，断续成环。韧皮部为多边形的小型细胞，排列紧密。形成层不明显。木质部约占茎横切面1/4，导管纵向排列。维管射线、髓射线明显，其细胞为类椭圆形，1~2 列纵向紧密排列。中央有明显的髓部，占比较大，约占茎横切面1/2，由薄壁细胞组成且部分细胞内具针晶束（图3）。

图3 穿根藤茎横切面

1.2.4 叶横切面显微鉴别 叶横切面表皮细胞排列紧密，类长方形。下表皮细胞比上表皮细胞大，且见较多的气孔、孔下室及非腺毛。叶肉上表皮下方具1~2 层薄壁细胞再下方为栅栏组织细胞。栅栏组织细胞纵向排列，较短小，由2~3 层短圆柱形细胞组成，几乎通过叶脉。海绵组织细胞明显，排列疏松，占叶肉横切面比例较大，易见侧脉维管束。主脉上下表皮内侧有2~3 层厚角组织，中央具半月型维管束，木质部在上方，呈马蹄状类圆形，导管放射性排列。形成层不明显。韧皮部在下方，且紧贴其下方具3~5 层明显的纤维细胞（图4）。

图4 穿根藤叶横切面

1.2.5 粉末显微鉴别 粉末为暗绿色。木纤维较多，成束或单个散在，两端钝平或尖，壁呈不均匀增厚，表面有明显的纹孔沟，直径10~20 μm。多见草酸钙针晶，成束或散在，长28~35 μm。淀粉粒单粒或复粒，呈卵圆形或椭圆形，脐点呈点状，直径5~8 μm。导管有螺纹导管、网纹导管、具缘纹孔导管和梯纹导管，直径18~35 μm。可见单细胞非腺毛，长30~55 μm。石细胞呈类方形或长方形，孔沟纹明显；长35~52 μm，宽30~40 μm。表皮组织清晰可见；气孔平轴式（图5）。

1.2.6 对照品溶液制备 精密称取车叶草苷对照品适量，加甲醇制成0.623 mg/mL 的溶液，取上清液即得。

1.2.7 供试品溶液制备 称取本品粉末（CGT-1，过24 目筛）约0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）1 h，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过蒸干，甲醇溶解定容至10 mL 容量瓶中，离心10 min（13 000 r/min）取上清液，即得供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 薄层鉴别

取穿根藤对照药材（编号CGT-1 为对照药材）0.5 g，制成对照药材溶液。再取车叶草苷对照品适量，加甲醇制成0.2 mg/mL 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述溶液各2 μL，点于同一硅胶Gf 薄层板上，以氯仿-甲醇-水（5-1.5-0.1）为展开剂，展开，取出晾干，喷10% 硫酸乙醇溶液，晾干，置紫外灯（254 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点（图6）。

图6 穿根藤药材薄层色谱

2.2 检查

2.2.1 水分 参照2015 年版《中国药典》四部水分测定法（通则0832 第二法）测定水分，15 批穿根藤药材水分为5.31%~11.20%（表2），均在12% 以下，从实际应用的角度考虑，初步拟定穿根藤药材水分不高于13.0%。

2.2.2 总灰分 参照2015 年版《中国药典》四部灰分测定法（通则2302）测定总灰分，15 批穿根藤药材总灰分为4.77%~7.06%（表2），从实际应用的角度考虑，初步拟定穿根藤药材总灰分不得超过8.0%。

2.2.3 酸不溶性灰分 参照2015 年版《中国药典》四部酸不溶性灰分测定法（通则2302）测定，酸不溶性灰分为0.09%~0.87%（表2），从实际应用的角度考虑，初步拟定穿根藤药材酸不溶性灰分不得超过0.9%。2.2.4 醇溶性浸出物 参照2015 年版《中国药典》四部醇溶性浸出物测定法项下的热浸法（通则2201）测定，用50% 乙醇作溶剂，15 批穿根藤药材浸出物含量在23.88%~35.30%（表2），均在23.0% 以上，从实际应用的角度考虑，初步拟定穿根藤药材醇溶性浸出物含量不得少于21.0%。

表2 15 批穿根藤药材的检查项测定结果（n=3）

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件 Agilent5TC-C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1% 磷酸（14∶86）为流动相，进样量10 μL，检测波长240 nm，柱温25 ℃，流速0.8 mL/min。对照品及供试品溶液HPLC 见图7。

图7 车叶草苷HPLC

2.3.2 标准曲线绘制 精密吸取上述车叶草苷对照品溶液（0.623 g/L）1 mL，分别置于1、5、10、25、50、100 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制系列车叶草苷对照品溶液。分别吸取上述6 个浓度的溶液10 μL，按选定的色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=5 234.1X-0.743 2，表明车叶草苷在0.006 23~0.623 g/L 与峰面积呈良好线性关系。

2.3.3 精密度试验 取同一车叶草苷对照品溶液（0.124 6 g/L），连续进样6 次进行测定，结果车叶草苷峰面积的RSD为0.99%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取穿根藤供试品溶液（CGT-1），分别于制备后0、2、4、6、8、16、24 h 进样10 μL 测定，结果测得车叶草苷峰面积RSD为2.05%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.3.5 重复性试验 称取穿根藤药材干燥粉末（CGT-1）0.5 g，共6 份，精密称定，测定并计算车叶草苷的含量，RSD为2.38%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收试验 精密称定已知含量的穿根藤药材干燥粉末（CGT-1）0.25 g，共6 份，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入车叶草苷对照品溶液（0.623 g/L）1.5 mL，制备供试品溶液，按色谱条件测定，测得平均加样回收率为99.83%，RSD为2.10%，结果见表3。

表3 穿根藤中车叶草苷的加样回收试验

2.3.7 样品测定 分别称取不同批次穿根藤干燥粉末0.5 g，精密称定，制备供试品溶液，按色谱条件测定车叶草苷含量，结果见表4。

表4 不同批次穿根藤中车叶草苷的质量分数（n=3）（单位：%）

3 讨论

通过对多产地的样品进行观察，壮药穿根藤药材性状特征主根不明显，茎圆柱形，茎上许多不定根，具细纵纹，叶对生，全缘，稍反卷。显微鉴别特征为根横切面具有明显的木质部，韧皮部外侧部分薄壁细胞具有针晶束；茎横切面韧皮部外侧具有石细胞群，髓部明显；叶横切面叶肉上表皮下方具1~2 层薄壁细胞，栅栏组织和海绵组织分化明显，主脉维管束半月形，韧皮部下方具纤维束；粉末中纤维束、石细胞、针晶等多见。薄层鉴别以氯仿-甲醇-水（5-1.5-0.1）为展开剂，展开，喷10% 硫酸乙醇溶液，置于紫外光灯（254 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显示相同大小和颜色的斑点。以上特征明显，专属性强，可作为穿根藤药材鉴别的参考依据。

3.1 TLC 鉴别

薄层色谱研究过程中，对供试品提取条件进行摸索。对甲醇、70% 甲醇、50% 甲醇、30% 甲醇、乙醇、70% 乙醇、50% 乙醇、30% 乙醇8 种不同极性的溶剂进行考察，最终以甲醇提取液所得薄层色谱图斑点最清晰。对冷浸12 h、超声1 h、水浴回流1 h 3种不同提取方法进行比较，结果表明，冷浸提取所得色谱图斑点较淡，超声和回流提取所得色谱图基本一致，以超声提取1 h 最为省时简便。对不同点样方式进行考察，发现点状点样方式所得薄层色谱图斑点不明显，而带状点样方式能清晰体现出斑点，以带状点样作为薄层点样方式。还对不同展开系统、药材取样量、不同显色剂及温湿度进行了考察，得出最稳定可靠的薄层鉴别方法。

3.2 HPLC 含量测定

前期研究发现，从穿根藤中能检出车叶草苷。车叶草苷具有抗菌、抗氧化，抗肿瘤、消炎镇痛等作用，这与穿根藤的功效主治具有一定相关性，故薄层鉴别中以车叶草苷为对照品，并且以车叶草苷为指标性成分进行含量测定。

穿根藤中车叶草苷的质量分数在0.019 6%~0.590 9%，大多数在0.10% 以上，其中上思县那琴乡联惠村（CGT-2）所得含量甚少，可能因药材存放时间过久所致；15 批穿根藤药材中车叶草苷含量较低的多采于春季，可能与春季多采集到新长叶片与嫩茎有关；考虑到不同产地不同采收时间的药材车叶草苷含量不一，建议按干燥品计算，将车叶草苷含量放宽至不少于0.10%。