牡丹不同木质化程度枝条的红外光谱分析

李秀丽，陈 镇，戢小梅，戴志刚，陈法志，陈志伟，翟敬华

（1.武汉市农业科学院林业果树研究所，武汉 430075；2.湖北省耕地质量与肥料工作总站，武汉 430070）

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）原产中国，属多年生落叶灌木，因极具观赏和药用价值而被人们熟知，目前已有2 000 多年的栽培历史［1，2］。近几年研究发现凤丹白（Paeonia ostii‘Fengdanbai’）籽仁中含油率较高，在22% 以上，高于国产大豆的含油率（17.5%）。牡丹籽油中富含氨基酸、蛋白质、多糖、类胡萝卜素、微量元素及维生素群和多种不饱和脂肪酸，尤其是α-亚麻酸的含量超过42.35%，被称为液体黄金［3］。2011 年国家卫生部批准牡丹籽油为一种非传统新植物油资源，在国内外掀起一股牡丹热，中国牡丹也将以油用牡丹的角色再次进入一个繁荣发展的历史时期。牡丹在生长和栽培中存在以下特征和问题：一，牡丹的生长不同于其他植物，存在“长一尺退八寸”的“退枝”现象。牡丹由多种木质化程度不同的枝条组成，包括木质化程度较高的多年生枝条、木质化程度次之的一年生新枝下部及木质化程度最低的一年生新枝上部，新枝上部因木质化程度低，耐寒性较差，冬季便自行枯死，仅剩一年生枝条的下半部越冬，这一部分才是牡丹枝条长度当年的实际生长量，仅为当年生长量的1/4~1/3，被称为“退枝”。二，高温是限制牡丹生长的重要环境因素，随着高温时间的延长，叶片出现失绿、黄化、焦枯、提早落叶，直至植株死亡。在中国本地，存在着一些较能适应高温的品种，如凤丹白，却仍然避免不了高温引起的生育期短、落花落果等现象的发生，严重阻碍了牡丹在长江中下游及以南地区的推广种植［4，5］。三，牡丹传统繁殖方法以播种、嫁接和分株为主，存在遗传性状不稳定和繁殖效率低的现象，无法满足市场需求。研究人员尝试通过扦插来提高牡丹的繁殖效率，但扦插效果有待提高［6］。值得注意的是，越来越多的研究显示，植物的生长特性与栽培中存在的问题与枝条的木质化程度息息相关，尤其是植物的耐热性和扦插效果等［6-8］。然而，有关牡丹枝条木质化方面的系统研究鲜有报道，本研究将从光谱学和蛋白质化学角度入手，解析不同木质化程度枝条的化学成分基础，深入解析牡丹的生长特性，并为提高牡丹抗性和扦插效果奠定理论基础。

FTIR（Fourier Transformation Infrared Spectrosco⁃py，FTIR）光谱技术的优势在于可以通过特征振动峰进行物质鉴定，是近年来广泛应用于农业材料上的一种新型光谱手段，可快速准确地分析农业材料（如花粉、植物油、中药、木材）的物质成分［9-13］。此外，借助FTIR，还可对蛋白质二级结构［9］、蛋白质反应的分子机制［14］和蛋白质的折叠［15］进行系统的分析。FTIR 图谱中氨基Ⅰ的振动在1 650 cm-1附近，主要来源于C=O 的伸缩振动及少量的CN 面外弯曲振动、CCN 变形振动和NH 的面内弯曲振动［16］。氨基Ⅰ振动峰的强度和峰型与蛋白质的骨架结构密切相关，而与蛋白质的侧链结构关系不大，即主要取决于蛋白质主链上的二级结构［17］。因此，一般选用氨基Ⅰ区域的振动峰进行蛋白质二级结构分析。本研究的目的是通过FTIR 技术分析比较牡丹不同木质化程度枝条中物质成分的差别及变化规律，并通过高斯多峰拟合从蛋白质化学角度分析各组织内蛋白质二级结构的分布特点及变化趋势，为其他相关研究提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

4 年生凤丹白苗购买于山东省菏泽市，2015 年10 月以大田栽植的方式种植于武汉市农业科学院林果所牡丹资源圃，种植密度为40 cm×80 cm。并根据牡丹苗生长情况统一进行浇水、施肥、除草以及病虫害防治管理。

1.2 傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征

切取新鲜的凤丹牡丹的茎和叶柄，先后用清水和去离子水（>18 MΩ）清洗，将清洗干净的牡丹植株器官（茎和叶柄）鲜样切碎后，置于110 ℃杀青1 h，75 ℃烘干至恒重。然后用球磨仪将样品粉碎成粉末（粒径小于2 μm）。采用KBr 压片法，即取1~2 mg干燥的样品与200 mg 干燥的KBr 研成均一细粉（粒径小于2 μm），以免散射光影响。底模装入模膛，往模心中加入少量样品，用药匙将模具中的样品刮平，并使其中心略高，将顶模放入模心，用（5~10）×107Pa压力在液压机上压成透明薄片（1~2 min），将KBr 压片夹放入红外光谱仪中（Bruker vertex 70）的透射配件中，以KBr 空白片（或空气）为参比，选用4 cm-1的分辨率，扫描128 次；波数范围4 000~400 cm-1［18］。

1.3 数据拟合及分析

借助Origin 8.0 统计软件对FTIR 原始数据进行作图，选取氨基I 区域（1 700~1 600 cm-1）的曲线并对其进行高斯单峰正态分布的曲线拟合，再根据不同蛋白质二级结构的FTIR 峰位，对拟合曲线再次进行高斯多峰拟合，具体分峰数依据结果而定。

2 结果与分析

2.1 凤丹白枝条的发育特点

凤丹白为落叶灌木，茎干直立，分支短而粗壮（图1a）。根据木质化程度不同，依次为：木质化程度最高的多年生枝条（枝条1），枝皮为褐灰色，有纵纹（图1b）；木质化程度次之的枝条，位于叶腋内有芽点（顶芽）的一年生枝条下部（图1b 和图1c），枝皮为浅黄绿色，称之为木质化程度较高的一年生枝条（枝条2）（图1b）；木质化程度最低的枝条主要是指叶腋内无芽点的一年生枝条上部（图1b 和图1c），将其定义为木质化程度较低的一年生枝条（枝条3）（图1c）。从枝条1 到枝条3 木质化程度逐渐降低。

图1 不同类型枝条的界定

2.2 枝条的FTIR 特征

和标准归属详见表1。结合图2 和表1 可以看出，不同木质化程度枝条的FTIR 特征峰差异较大，也存在一定的规律性，比如778 和3 420 cm-1处的特征峰随木质化程度的增加而逐渐减弱。778 cm-1特征峰是由于C-C 伸缩振动引起，属于碳水化合物［19］，表明枝条中碳水化合物的含量随木质化程度的增加而降低；3 420 cm-1处的特征峰归属于OH 伸缩振动，主要源于组织中脂肪酸、各种碳水化合物（果胶、半纤维

图2 枝条的FTIR 图谱的比较

表1 枝条FTIR 图谱的主要峰位及其归属

图2 表明，凤丹白不同类型的枝条从4 000 cm-1到400 cm-1共存在12 个特征峰，其对应的振动频率素、多糖）等对光谱的贡献［20］。1 253、1 385、1 461 和1 738 cm-1处特征峰的振动强度随木质化程度的增加而逐渐增强。1 253 和1 738 cm-1处特征峰分别对应磷脂质和核酸的P=O 对称伸缩振动［21］以及磷脂质和油脂的C=O 伸缩振动［22］；1 385 cm-1处的特征峰代表CH3和CH2的对称变形弯曲振动，主要来源于蛋白质、脂质和木质素［21］；1 461 cm-1为蛋白质、脂类和木质素的CH3和CH2反对称变形弯曲振动［21，22］，可见木质化程度高的枝条中含有更多的木质素成分。1 043 cm-1特征峰的峰位在枝条1 到枝条3 的过程中分别发生了蓝移，枝条1 中1 043 cm-1处振动峰，枝条2 和3 中，变为1 053 cm-1，此区域峰位对应细胞壁多糖COH 变形振动或C-O 伸缩振动［22，23］。表明凤丹白枝条1 的细胞壁多糖以葡甘露聚糖为主，而枝条3 的细胞壁多糖以阿拉伯聚糖为主。枝条1 和2中1 426 cm-1特征峰在枝条3 中移动至1 410 cm-1。据文献报道1 450~1 410 cm-1属于果胶或氨基酸COO-的对称伸缩振动峰［22，24］。此外，1 511 cm-1处特征峰属于氨基II 的N-H 伸缩振动［25］，该峰峰强随木质化程度的降低而减弱，枝条3 中则不存在此峰。1 636 cm-1为氨基I 的C=O 伸缩振动和NH 弯曲振动，与蛋白质二级结构相关［22］，其他特征峰无明显变化趋势。

2.3 不同种类枝条的蛋白质二级结构特性

为了进一步分析凤丹白不同类型枝条中蛋白质二级结构的特征及其差异性，对1 700~1 600 cm-1处的红外吸收峰进行详细分析。首先对1 700~1 600 cm-1的原始谱图（图3 中黑色实线）进行高斯单峰拟合，拟合方程为：

不同枝条中拟合方程的具体参数见表2，高斯单峰拟合曲线如图3 中黑色实线。

表2 枝条中氨基I（1 700~1 600 cm-1）区域的拟合参数

根据蛋白质二级结构的峰位（表3 所示），再对拟合单峰（图3 中红色实线）进行高斯多峰拟合［9］。1 700~1 600 cm-1存在5 种蛋白质的二级结构，波数从低到高为：β+S+P、β、α、L+T 和β+T，其中L、T、α、β、S 和P 分别代表环（loop）、转角（turn）、α-螺旋（αhelix）、β-折叠（β-sheet）侧链（side chain）和果胶（pectin）（图3）。枝条1、枝条2 和枝条3 中蛋白质二级结构的种类及其比例如图4 所示，对于同一组织而言，牡丹枝条1 中蛋白质的二级结构β +S+P（36.69%）>β（25.78%）>α（20.96%）>L+T（14.31%）>β +T（2.26%）；牡丹枝条2 中β +S+P（44.11%）>α（30.37%）>β（12.81%）>L+T（12.71%）>β+T（0%）；牡丹枝条3 中β+S+P（40.41%）>α（29.35%）>β（17.15%）>L+T（13.09%）>β+T（0%）。对于同一种蛋白质二级结构而言，β+S+P：枝条2>枝条3>枝条1；β：枝条1>枝条3>枝条2；α：枝条2>枝条3>枝条1；L+T：枝条1>枝条3>枝条2；β+T：枝条1>枝条2=枝条3；牡丹不同类型的枝条中所含蛋白质二级结构的共同点是α和β 结构所占比例之和所占比例最多（43%~47%），其次是β+S+P（36%~45%），再次是L+T（10%~15%），最少为β+T 的二级结构（0%~3%）。蛋白质二级结构所占比例与枝条的木质化程度存在一定关系：随着木质化程度的降低（枝条1 到枝条2，再到枝条3），β+S+P 和α 均出现先增加后平稳的趋势；β 呈先降低后平稳的趋势；L+T 变化较为平稳。

表3 用于曲线拟合的枝条中蛋白质二级结构及波数

图4 基于高斯多峰拟合分析枝条内蛋白质二级结构的百分比

3 小结与讨论

牡丹的枝条按木质化程度不同，包括木质化程度最高的多年生枝条（枝条1）、木质化程度较高的一年生枝条（枝条2）、木质化程度较低的一年生枝条（枝条3）（图1）。前人主要关注牡丹的茎结构与抗寒性关系以及不同发育时期茎中糖类物质的变化［26，27］。本研究借助FTIR 技术和高斯拟合分析方法重点研究枝条木质化程度与化学成分和分子构象的关系，从光谱学和蛋白质化学角度为解析牡丹枝条木质化程度的差异性提供理论基础。

3.1 FTIR 解析凤丹白不同木质化程度枝条的化学成分特性

FTIR 通过分子振动或转动引起的偶极矩变化鉴定化合物的分子结构，也可用于物质的定量分析［28］。Lakshmi［29］利用FTIR 对防风草叶片中多种化合物进行了鉴定；Lahlali 等［9］借助FTIR 揭示了热胁迫下豌豆花粉粒中脂质和蛋白质的变化规律；Chatjigakis 等［30］通过FTIR 技术研究了桃细胞壁上果胶的酯化程度。而本研究借助FTIR 技术详细分析了不同类型枝条中特征化合物的种类及其变化规律，结果表明不同木质化程度的枝条在物质成分上存在较大差别。枝条1 的木质化程度高，所以木质素含量较其它类型枝条高（1 385 和1 461 cm-1）（图2）。一年生枝条细胞分裂较快，单个植物细胞在生长过程中其体积可膨胀大约20 000 倍，因此细胞壁必须均匀协同生长，才能保持结构的完整性，以维持足够的强度抵抗来自胞内5 个大气压的压力并防止由于细胞壁局部缺陷造成的细胞“大出血”（细胞质外渗）［31，32］。细胞壁的主要组分包括纤维素、半纤维素和果胶［33］。纤维素在不同类型枝条中的含量变化不大，而与果胶相关的特征峰强度（3 420 cm-1）（表1）在一年生枝条中逐渐增强，且果胶的另一特征峰（1 410~1 450 cm-1）从枝条1 到枝条3 中发生红移现象（表1），主要是因为果胶中COO-以单齿络合方式与金属离子结合时，其振动频率将显著低于游离的COO-［34］，因此，推测枝条3 细胞壁中果胶以单齿络合的形式与金属离子（如Ca2+）结合，从而促进细胞壁的有序自组装，确保细胞壁的刚性和完整性。

3.2 枝条木质化程度与蛋白质二级结构的关系

植物体内行使调节功能的往往是蛋白质，为了进一步理解不同木质化程度枝条的蛋白质基础，本研究对3 种类型枝条分别进行了氨基Ⅰ区域的曲线拟合分析，详细调查不同类型枝条蛋白质二级结构的差异。总体来说，不同木质化程度的枝条均含有多种不同的蛋白质二级结构（图4）。β-折叠+侧链+果胶在枝条2 和3 中含量高于枝条1（图4）。结合上述分析可知，木质化程度最低的枝条3 需要更多的果胶维持细胞快速分裂时细胞壁的完整性，推测与果胶相连的β-折叠结构能调控果胶在细胞壁结构中的自组装过程。除此之外，α-螺旋在一年生枝条中的含量也高于多年生枝条（图4），Lahlali 等［9］指出经高温胁迫的豌豆花粉粒，其α-螺旋出现显著下降，Wolkers 等［35］发现当香蒲花粉粒受到高温胁迫时，α-螺旋也出现下降趋势，这些研究提出降低α-螺旋结构的含量可以弥补因高温引起的蛋白质-水之间氢键减少而造成的危害，从而抑制失水对植物造成的危害。据此推测，木质化程度高的多年生枝条1 比一年生枝条蛋白质α-螺旋结构的含量少，是由于枝条木质化升高后，细胞所含水分减少，蛋白质-水之间的氢键也随之减少，凤丹白主动调控降低蛋白质中α-螺旋结构的含量，减少木质化组织中因氢键缺失而对植株造成的危害。另外当体内的ATP（Adenosine Triphosphate，三磷酸腺苷）被修饰后（如ATP 与核酸反应），其结合能的改变会引起蛋白质二级结构构象的改变，如β-折叠和转角结构会减少［36］。本研究发现枝条1 中β-折叠和转角的二级结构较当年生新枝高，可以推测在木质化程度高的枝条中ATP 主要是以游离态存在，为植物生长提供能量基础；而木质化程度较低的一年生新枝则利用ATP 进行物质代谢，为株系生长提供物质基础。

凤丹白枝条由多年生枝条（枝条1）和一年生枝条组成，一年生新枝又以顶芽为界分为木质化程度较高的下部枝条（枝条2）和木质化程度较低的上部枝条（枝条3）。枝条1 中含有较多的木质素，枝条2和3 细胞壁中含有较多的果胶，尤其是枝条3 中果胶上的羧基以单齿络合方式与金属离子结合，且存在许多与果胶相连的蛋白质，有助于植株主动调控细胞生长分裂时细胞壁的重新构建过程。枝条1 蛋白质的二级结构中α-螺旋含量较少，可以有效降低多年生枝条木质化组织中因蛋白质-水之间的氢键缺失而对植株造成的危害；枝条1 中含有较高的β-折叠和转角，表明木质化程度高的多年生枝条中ATP主要是以游离态存在，可为植物生长提供能量基础；枝条2 和枝条3 的蛋白质二级结构中含有较少的β-折叠和转角，表明木质化程度低的枝条中ATP 已被修饰，利用ATP 合成了株系生长所需的物质，为植株生长提供物质基础。