农杆?菌介导葡萄灰葡萄孢遗传转化条件优化

李廷刚，巩东营

（1.山东省葡萄研究院，山东 济南 250100；2.山东省农业科学院农产品加工与营养研究所，山东 济南 250100）

灰霉病是葡萄生长及贮存期的重要病害，在我国主要由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染所致［1］。灰葡萄孢在自然界中可侵染200多种植物，包括番茄、丝瓜、草莓、葡萄等［2］，多以菌核在植株或者病残体上越冬，翌年通过分生孢子传播［3］。灰葡萄孢在葡萄生长过程中可侵染植株嫩茎、叶片、花穗、果实等大部分地上组织，发生严重时，可造成减产60%以上；在葡萄贮藏期是第一大病原菌，一旦发生可造成葡萄果粒腐烂，影响贮藏品质，造成严重损失［4］。灰葡萄孢寄主范围广、变异速度快、抵御不良环境能力强，因此防治极为困难。寻找灰葡萄孢致病基因、探索致病机制，可为灰霉病综合防控奠定基础。

遗传转化是研究病原菌致病基因功能的重要技术基础，农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）是目前应用较为广泛的转化技术［5］。农杆菌可以侵染真菌细胞，利用所携带的Ti质粒，将T-DNA区随机整合到受体细胞的基因组中，转化过程受到多种小分子多糖及酚类物质等的双重调节，其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）在该过程中起促进作用［6］。ATMT技术因其转化受体要求低、操作流程简单、转化效率高、转化子稳定性强、转化子单拷贝插入等优势，目前已在水稻稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、橡胶树炭疽病菌（Colletotrichum musae）等多种病原真菌中得到广泛应用［7-10］。

目前，在灰葡萄孢遗传转化研究中，ATMT技术也得到了较好的应用。陶岚［11］利用ATMT技术构建了草莓灰葡萄孢突变体库，并从中筛选出463个致病力异常的转化子。王璇等［12］通过筛选基于ATMT技术构建的番茄灰葡萄孢突变体库，得到分生孢子产生缺陷转化子BCt78。范雷等［13］通过优化月季灰葡萄孢RoseBc-3的ATMT体系，筛选获得6类不同表型转化子。沈卫锋等［14］利用ATMT技术成功获得了绿色荧光蛋白重组灰葡萄孢。Zhang等［15］通过筛选番茄灰葡萄孢ATMT突变体库，得到分生孢子产生缺陷转化子BCG183，定位确定候选基因BcKMO，进一步证明该基因可参与调控细胞壁降解酶活性、毒素活性和细胞壁完整性等。不同寄主灰葡萄孢具有其自身特异性，目前鲜有关于葡萄灰葡萄孢ATMT的相关研究。本试验以分离自葡萄的灰葡萄孢BcSD3菌株为材料，研究建立并优化其ATMT体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

葡萄灰葡萄孢BcSD3菌株（高毒力菌株），于2020年7月分离自山东烟台‘巨峰’葡萄灰霉病花穗。根癌农杆菌EHA105菌株、质粒pBIG3C（含潮霉素抗性基因）均由本实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 灰葡萄孢分生孢子制备 将灰葡萄孢BcSD3菌株接种于PDA培养基上，参照李廷刚等［16］报道的方法进行诱导产孢；使用灭菌水洗脱分生孢子，并用三层灭菌滤纸过滤去除菌丝等杂质；离心收集分生孢子，并调节至适宜浓度，保存备用。

1.2.2 根癌农杆菌菌液制备 采用热击法将pBIG3C质粒转入根癌农杆菌EHA105菌株中；筛选阳性菌斑接种于LB液体培养基（含50μg/mL卡那霉素）中，于28℃条件下摇培2 d；离心收集菌体，用诱导培养基将菌液稀释至OD600值等于0.15，继续培养直至OD600值达到0.8。

1.2.3 灰葡萄孢对潮霉素B敏感性测定 制备分别含有5、10、25、50、100μg/mL潮霉素B的PDA平板，以不添加潮霉素B的PDA平板作为对照，用打孔器打取灰葡萄孢菌饼接种在PDA平板中心位置；于23℃光暗交替条件下培养3 d，观察菌落生长情况，每个处理6个平板，设置3次重复。

1.2.4 农杆菌对头孢噻肟钠敏感性测定 制备分别含有50、100、200、300、400μg/mL头孢噻肟钠的PDA平板，以不添加头孢噻肟钠的PDA平板作为对照，取已制备的OD600值为0.15的农杆菌菌液均匀涂布于平板上；于28℃黑暗条件下培养3 d，观察菌落生长情况，每个处理6个平板，设置3次重复。

1.2.5 遗传转化条件优化 在含有不同浓度乙酰丁香酮（AS）的共培养培养基平板上平铺一张玻璃纸，取100μL农杆菌与灰葡萄孢分生孢子混合液均匀涂布于玻璃纸上，在不同温度条件下共培养不同时间，后将玻璃纸转移至新的灭菌培养皿内，覆盖PDA培养基（内含50μg/mL的潮霉素B和300μg/mL的头孢噻肟钠），在适宜温度条件下光暗交替培养5 d，查看转化子生长情况。其中所用灰葡萄孢分生孢子浓度分别为1×102、1×103、1×104、1×105、1×106个/mL；所用AS浓度分别为100、200、300、400μmol/mL，以不添加AS培养基平板作为对照；共培养温度分别为15、20、25、30、35℃；共培养时间分别为24、48、72、96、120 h。

1.2.6 转化子检测与鉴定 随机选取8个转化子接种于不含抗生素的PDA平板上，待菌落生长至平板3/4面积时，打取菌饼转接至新的不含抗生素的PDA平板上，连续转接3代。之后打取菌饼，接种至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板上，观察菌落生长情况，重复3次。使用CTAB法提取野生型灰葡萄孢和8个转化子的基因组DNA，分别扩增潮霉素磷酸转移酶（hph）基因的特异片段。对野生型灰葡萄孢和8个转化子的基因组DNA进行HindⅢ单酶切，酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳分析；以hph基因的特异扩增片段为模板，探针标记与检测方法具体试验步骤参照地高辛标记检测试剂盒（罗氏）说明书进行。

1.3 数据处理与分析

使用Microsoft Excel 2010及SPSS 19.0进行数据统计及分析。

2 结果与分析

2.1 灰葡萄孢对潮霉素B敏感性测定

不同浓度潮霉素B对灰葡萄孢抑制作用测定结果如图1所示，接种灰葡萄孢3 d后，与对照相比，5、10、25μg/mL潮霉素B可对灰葡萄孢菌丝生长产生不同程度的抑制作用，但仍可以生长；当潮霉素B浓度达到50μg/mL时，则可以完全抑制灰葡萄孢菌丝的生长。因此，本试验选择50 μg/mL潮霉素B作为转化子的筛选浓度。

图1 灰霉病菌在含有不同浓度潮霉素B的PDA培养基上生长情况

2.2 根癌农杆菌对头孢噻肟钠敏感性测定

不同浓度头孢噻肟钠对农杆菌抑制作用如图2所示，农杆菌涂布后培养3 d，对照组农杆菌遍布整个平板，随着头胞噻肟钠浓度的不断提高，存活农杆菌菌落数不断减少，抑制效果不断增强；当浓度增至300μg/mL时，可完全抑制其生长。因此，本试验选择300μg/mL头孢噻肟钠作为转化子的筛选浓度。

图2 农杆菌在含有不同浓度头孢噻肟钠的PDA平板上生长情况

2.3 分生孢子浓度对转化效率的影响

由图3可知，随分生孢子浓度的增加，每培养皿得到的转化子数量不断增加。分生孢子浓度为1×102、1×103、1×104、1×105、1×106个/mL每培养皿分别平均得到3、9、14、31个和67个转化子。基于试验操作和转化子特异性综合考虑，分生孢子浓度1×105个/mL为最适转化浓度。

图3 不同分生孢子浓度对转化效率的影响

2.4 乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响

当不添加AS时，每个培养皿平均仅得到2个转化子；随着AS浓度不断提高，转化子数量不断增加，浓度为200μmol/mL时每个培养皿平均可得到33个转化子；之后，随着AS浓度不断增加转化子数量不断减少（图4）。因此，AS浓度200μmol/mL为最佳转化浓度。

图4 不同乙酰丁香酮浓度对农杆菌转化效率的影响

2.5 共培养温度对转化效率的影响

当共培养温度为15℃时，每培养皿平均可得到7个转化子；随着共培养温度不断升高转化子数量呈先增加后减少的趋势，25℃时转化效率最高，每培养皿平均可得到32个转化子，当共培养温度达到35℃时，每培养皿平均转化子数量下降到11个（图5）。因此，25℃为最佳共培养温度。

图5 共培养温度对转化效率的影响

2.6 共培养时间对转化效率的影响

当共培养时间为24、48、72、96、120 h时，每皿分别平均可得到18、33、34、26个和22个转化子；其中，共培养时间为48 h和72 h时转化效率相当，且无显著差异（图6）。共培养时间越长转化子有多拷贝插入的比例越高，因此，48 h为最适共培养时间。

图6 共培养时间对转化效率的影响

2.7 转化子稳定性检测及分子鉴定

随机选取8个转化子进行遗传稳定性检测，结果显示，在含有50μg/mL潮霉素B的PDA培养基平板上所有转化子均可正常生长。潮霉素磷酸转移酶基因特异片段扩增结果如图7a所示，灰葡萄孢野生型中无条带，8个转化子中均可扩增到特异性条带，且大小与对照相同。表明，TDNA片段已经整合到灰葡萄孢基因组中，并且可以稳定遗传。

转化子Southern blot检测结果如图7b所示，灰葡萄孢野生型中无任何条带，8个转化子均可得到特异性条带，其中6个转化子为单拷贝插入，2个转化子为双拷贝插入，单拷贝插入比例可达到75%。表明hph基因已经整合到灰葡萄孢基因组中，且多以单拷贝形式插入。

图7 转化子PCR检测及Southern blot分析

3 讨论与结论

遗传转化是研究真菌基因功能的重要技术手段，常用的遗传转化技术包括PEG介导的原生质体遗传转化、限制酶介导的原生质体遗传转化等［17-19］。ATMT技术因其无需制备原生质体、单拷贝插入率高、操作流程简单、转化效率高等优点，在多种真菌遗传转化研究中得到了较好的应用［20，21］。但不同真菌间、甚至同一真菌不同种间的遗传转化条件存在较大差异，主要受共培养培养基中AS浓度、共培养液中分生孢子浓度、共培养温度以及共培养时间等因素影响。本研究建立了葡萄灰葡萄孢ATMT体系，为开展其基因功能研究奠定了技术基础。

分生孢子浓度与转化效率大致呈正相关趋势，这主要是因为分生孢子浓度的提高增加了农杆菌侵染的概率，从而提高了转化效率。由于一个培养皿中转化子过多会造成菌落相互覆盖，不利于后期转化子的分离纯化，因此分生孢子应选择适宜浓度。AS对Ti质粒上vir基因的活化起重要作用，因此在共培养培养基中需加入适当浓度的AS以提高转化效率。本研究中AS最佳浓度为200μmol/mL，之后随着浓度继续提高，转化效率逐渐下降。推测这可能是因为过高浓度的AS对转化子产生了毒害作用，抑或是抑制了Ti质粒上的vir基因的表达，从而导致转化效率下降。

共培养温度对转化效率的影响呈正态分布趋势，最佳共培养温度为25℃，过低或者过高均会导致转化效率下降。推测这可能是因为灰葡萄孢分生孢子具有自己最适的生长温度；同时，Ti质粒上vir基因的表达也较易受到温度的影响。本研究中最适共培养时间为48 h，共培养时间过短会导致农杆菌未能完成侵染，从而造成转化效率不高；共培养时间过长，也会导致转化效率下降。这或许是因为共培养时间过长导致转化子生活力衰弱，从而影响转化效率。此外，共培养时间过长还易导致转化子中多拷贝插入的现象，为后续开展基因功能研究带来不便［22］。