辣椒疫病生防菌的防病促生作用及其鉴定

张德珍，迟文娟，李婷婷，代惠洁，乔宁，王翠翠

（潍坊科技学院/山东省高校设施园艺实验室，山东 寿光 262700）

辣椒（Capsicum annuumL.）是我国种植面积最大的蔬菜作物之一［1］。随着我国设施辣椒栽培量的逐年增加，辣椒疫病已成为严重影响辣椒产量和品质的一种毁灭性土传真菌病害。该病害在辣椒整个生育期均可发生，其病原菌辣椒疫霉（Phytophthora capsici）寄主广泛，能够侵染并严重危害辣椒、黄瓜、番茄、大豆、南瓜等多种植物［2］，并且可以在土壤中长期存活，造成该病害一旦传入就难以根治，严重时可造成毁棚，导致巨大的经济损失。因此在设施蔬菜栽培中对辣椒疫病的防控意义重大。

目前生产上普遍采用的化学药剂防治方法不仅难以根除辣椒疫病，还容易使病原菌产生抗药性，造成环境污染，甚至影响人类健康。相比之下，生物防治以其安全、无毒、环保等特点，在防治蔬菜病害方面优势凸显。因此，优质生防菌种发掘和高效生防菌剂开发，对于辣椒疫病的生物防控具有重要意义。在生防细菌中芽孢杆菌（Bacillusspp.）的应用最为广泛。研究发现，部分芽孢杆菌可以通过非核糖体途径合成脂肽类化合物，包括表面活性素家簇（surfactins）、丰原素家簇（fengycins）和伊枯草菌素家簇（如iturins、bacillomycins和mycosubtilin）［3］，其中丰原素和伊枯草菌素都具有较强的抑制真菌生长的作用［4］。另外，有些芽孢杆菌还可以通过溶磷固氮作用、分泌植物生长激素和促进植物营养功能等方式促进植物生长［5-8］。目前，对具有产脂肽类化合物能力的生防菌的研究主要集中在防治病害方面，而同时研究其促生作用的报道较少。

由于生防菌防病和促生效果的发挥与土壤环境条件有关，因此获得适宜当地土壤生态环境的优良生防菌株资源，是开发高适配性生防菌剂、实现设施蔬菜病害绿色防控的关键环节［9］。前期从寿光多年进行设施蔬菜栽培的土壤中筛选获得了多株对辣椒疫霉菌具有显著抑制效果的芽孢杆菌菌株，本试验通过体外试验和盆栽试验比较其防病效果和促生能力，检测了F1-1菌株基因组中脂肽类化合物合成相关基因，并对其进行分子生物学鉴定，以期为研发与蔬菜产地环境适配性更好的生防菌剂和生物农药提供优质的生防菌资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

生防菌菌株：从山东省寿光市多年栽培蔬菜的设施土壤中分离并保存。

供试病原菌：辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici），由本实验室分离鉴定后保存。

供试辣椒：香辣一号，由寿光市宏伟种业有限公司生产。

供试药剂：50%烯酰吗啉可湿性粉剂，由德国巴斯夫股份有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 生防菌发酵液及其脂肽类化合物的制备

挑取活化的生防菌株单菌落，接种于LB液体培养基（20 mL）中，于32℃、200 r/min的培养箱中振荡培养24 h，制成种子液。将种子液按照1%的接种量接种于LB液体培养基中，以上述同样条件振荡培养48 h，用无菌培养液调整发酵液至菌体含量为1×108cfu/mL，调整后的发酵液用于生防菌与辣椒疫霉病菌的对峙试验和对辣椒防病促生效果的盆栽试验。

按照上述方法完成接种的培养液在29℃、200 r/min的条件下振荡培养96 h后，将发酵液离心除去菌体（6 000 r/min，15 min），用6 mol/L盐酸将上清液调至pH=2.0，于4℃冰箱中静置24 h后，离心收集沉淀（10 000 r/min，10 min），用发酵液1/10体积的甲醇溶解沉淀，经0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，获得脂肽类化合物提取物，氮吹仪吹干后用无菌水溶解，使脂肽类化合物的质量浓度为50μg/mL，保存于-20℃冰箱备用。

1.2.2 辣椒疫霉孢子液的制备 将活化的辣椒疫霉菌接种于PDA平板上，25℃培养箱黑暗条件下倒置培养5～7 d后，将菌落连同培养基一起切成0.5 cm×0.5 cm的小块，加入无菌水，光照条件下培养24 h，于4℃冰箱中静置30 min，待游动孢子释放后收集孢子液，调整游动孢子含量约为1×105cfu/mL，用于生防菌对辣椒疫病防治效果试验。

1.2.3 生防菌及其脂肽类化合物对辣椒疫霉菌的抑制活性测定 以供试辣椒疫霉菌为靶标菌，分别采用平板对峙法和琼脂孔扩散法测定生防菌及其脂肽类化合物对辣椒疫霉菌的抑制活性。将经活化的辣椒疫霉菌饼接种于PDA平板中央，在菌饼两侧距离平板边缘1 cm处接种5μL的生防菌菌悬液（1×108cfu/mL），或在PDA平板相应位置打孔并滴加200μL脂肽类化合物提取液，于28℃培养箱内静置培养5～7 d，测量病原菌的菌落直径，参照范晓静等［10］的方法计算抑菌率。每个处理接种3个平板，分别以滴加5μL和200 μL无菌水作为对照，设3次重复。

1.2.4 生防菌对辣椒疫病的防治作用试验 将8～10叶期的辣椒苗移栽至装有灭菌基质∶灭菌土壤=1∶1的花盆（Ф=10 cm）中，随机分为5组，每组12棵（1棵/盆）。3个处理组分别用30 mL的F1-1、F1-3、F1-7发酵液均匀浇灌各盆辣椒根围土壤，以30 mL无菌培养液灌根处理作为对照1（CK1），以相同体积的50%烯酰吗啉可湿性粉剂1 000倍液灌根处理作为对照2（CK2），24 h后于辣椒苗根部接种5 mL辣椒疫霉孢子液。接种后10～15 d调查发病情况。试验设3次重复。参照毛爱军等［11］的辣椒疫病病情分级标准进行统计，计算病情指数。病情指数=∑（病级株数×代表级数）/（植株总数×最高代表级值）×100，参照李丹等［12］的方法计算防治效果。

1.2.5 生防菌对辣椒生长的影响试验 将辣椒苗随机分为4组，每组12株（1株/盆），处理组每盆分别用30 mL F1-1、F1-3、F1-7的发酵液（1×108cfu/mL）灌根，对照（CK）组浇灌无菌培养液。处理21 d后，分别测定每株辣椒的株高、茎粗、全株鲜质量和全株干质量，并计算壮苗指数。试验设置3次重复。壮苗指数=（茎粗/株高）×全株干质量。

1.2.6 F1-1脂肽类化合物合成相关基因的检测 采用细菌基因组DNA提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）提取F1-1的基因组DNA，以此为模板，分别用表1中的引物进行PCR扩增。扩增体系：2×Easy Taq®PCR SuperMix（北京全式金生物技术有限公司）12.5μL，DNA模板（50～100 ng/μL）1μL，引物（100μmol/L）各0.5 μL，加ddH2O补至25μL。扩增程序：94℃3 min；94℃30 s，55℃50 s，72℃30～120 s，32个循环；72℃8 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带经胶回收后，通过TA克隆的方法分别将DNA片段连接到pEasy-T1（北京全式金生物技术有限公司）载体上，将筛选获得的阳性克隆进行测序，所得序列利用DNAMAN 6.0软件和NCBI数据库的相关在线软件进行同源性检索和序列分析。本试验中所用引物的合成和DNA片段序列的测定均由北京六合华大基因科技有限公司完成。

表1 脂肽类化合物合成酶相关基因扩增的引物序列

1.2.7 F1-1菌株的分子鉴定 以F1-1菌株的基因组DNA为模板，对gyrA序列进行PCR扩增，引物序列［17］为gyrA-F：5′-ATTCACGCTATCACTGACTTATTC-3′和gyrA-R：5′-ATGGGAGACAAAGTAGAACCGAG-3′。扩增体系同1.2.6，扩增程序：94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃120 s，32个循环；72℃8 min。扩增产物经TA克隆后进行测序，DNA序列经NCBI数据库和DNAMAN 6.0软件的比对分析，利用MEGA 6.0软件，采用邻接法（neighbor joining，NJ）构建系统发育树。

1.3 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2017和SPSS 20.0软件进行数据处理及统计分析；Duncan’s新复极差法对试验数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 生防菌及其脂肽类化合物对辣椒疫霉菌的抑制活性

平板对峙培养试验结果（图1）表明，供试5株生防菌对辣椒疫霉均表现出明显的抑菌效果。F1-1菌株对辣椒疫霉菌的抑制效果最好，抑菌率可达50.95%，显著高于其余4个菌株。其次为F1-3和F1-7菌株，抑菌率约为40%左右。

图1 不同生防菌株对辣椒疫霉菌的抑制活性

琼脂孔扩散试验表明，5个生防菌株的脂肽类化合物（50μg/mL）均具有抑制辣椒疫霉菌菌丝生长的作用。由图2可知，从F1-1发酵液中提取的脂肽类化合物的抑菌效果最好，抑菌率为55.71%，显著高于其余4个菌株。其次为F1-3菌株，抑菌率为48.71%。表明产生脂肽类化合物可能是这些生防菌对辣椒疫霉病菌表现出抑制活性的一个重要原因。

图2 不同生防菌株脂肽类化合物提取物 对辣椒疫霉菌的抑制活性

2.2 生防菌对辣椒疫病的防治作用

选择体外试验中抑菌效果较好的3个生防菌株F1-1、F1-3和F1-7进行盆栽试验。由表2可以看出，3个供试菌株对辣椒疫病均具有一定的防治效果。与CK1相比，用生防菌发酵液灌根处理能显著降低辣椒疫病的病情指数，其中F1-1处理组的病情指数最低，为23.33，虽然略高于CK2组（21.11），但两者之间差异不显著。在本试验条件下，3个菌株的防治效果均可达到50%以上，F1-1组和施用化学药剂的CK2组的防治效果显著高于F1-3和F1-7处理组，其中F1-1的防治效果可达到66.91%，其生防效果在3个供试菌株中最好。

表2 不同生防菌对辣椒疫霉的防治效果

2.3 生防菌对辣椒生长的影响

盆栽试验结果表明，F1-1、F1-3和F1-7均可促进辣椒生长。由图3可知，与对照组相比，经F1-1和F1-7灌根处理的辣椒株高显著增加，增幅分别为21.73%和16.01%；经F1-1灌根处理的辣椒茎粗比对照组显著增加15.17%，F1-3和F1-7处理组的茎粗虽然也有所增加（增幅为6.89%和8.51%），但是差异不显著。

图3 不同生防菌对辣椒株高和茎粗的影响

由图4可知，经F1-1和F1-3灌根处理的辣椒，全株鲜质量和干质量比CK组显著增加，其中，经F1-1灌根处理的辣椒全株鲜质量和干质量最高，分别为30.17 g和2.89 g，说明F1-1可以促进辣椒植株生长并积累更多的干物质。由图5可知，在供试的3个菌株中，F1-1处理组辣椒的壮苗指数最高，并显著高于CK组，增幅为44.00%。表明在本试验条件下，用F1-1灌根处理对辣椒具有较好的促生效果。

图4 不同生防菌对辣椒植株鲜质量和干质量的影响

图5 不同生防菌对辣椒壮苗指数的影响

2.4 F1-1菌株脂肽类化合物合成相关基因的检测

通过PCR从F1-1基因组DNA中扩增得到了7个脂肽类化合物合成相关基因（图6），表明F1-1具有合成多种脂肽类化合物的潜力。将获得的DNA片段克隆测序后进行BLAST同源性分析，结果表明从F1-1菌株扩增的7个基因序列与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）中相应的拮抗物质合成功能基因序列的同源性在96%以上，说明利用特异引物扩增到的基因片段为相应的拮抗物质合成相关基因序列。

图6 F1-1菌株脂肽类化合物合成相关基因的PCR产物电泳图

2.5 F1-1菌株的分子鉴定

以F1-1菌株的基因组DNA为模板，采用gyrA基因特异性引物进行PCR扩增，经测序分析，得到一段长度为2 424 bp的DNA序列。由系统发育进化树（图7）可知，F1-1菌株与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisBY6（NZ_CP051011）亲缘关系最近，同源性达到100%，因此将F1-1菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。

图7 F1-1菌株基于gyrA基因序列的系统发育树

3 讨论与结论

辣椒疫病是设施蔬菜生产上的一种危害严重又难于根治的土传真菌病害，针对该病害的防控是目前设施蔬菜栽培中生物防治领域的研究热点。汪涛等［18］采用喷淋的方法对辣椒茎基部施用多粘类芽孢杆菌TC35的发酵液，防治效果达80%以上；郝楠等［19］对侧孢短芽孢杆菌A60菌株进行室内防效测定，该生防菌对辣椒疫病的防治效果可达70%。本试验结果表明，在室内盆栽条件下，F1-1菌发酵液能有效降低辣椒苗感染疫病的病情指数，防治效果可达66.91%，高于杨定祥等［20］报道的解淀粉芽孢杆菌SH-27菌株的发酵液对辣椒疫病的防治效果（48.20%）。

目前已报道的对辣椒疫病有较好防治效果的生防细菌主要集中在芽孢杆菌属，包括枯草芽孢杆菌（B.subtilis）［21］、解 淀 粉 芽 孢 杆 菌（B.amyloliquefaciens）［20，22］、短小芽孢杆菌（B.pumilus）［23］、多 粘 类 芽 孢 杆 菌（Paenibacillus polymyxa）［18，24］和 侧 孢 短 芽 孢 杆 菌（B.laterosporus）［21］等。本试验对生防效果较好的F1-1菌株进行了基于gyrA基因的特异性序列分析及同源性比对，通过构建系统发育树，确定菌株F1-1为贝莱斯芽孢杆菌。Ruiz-García等［25］研究报道，贝莱斯芽孢杆菌能够分泌产生表面活性剂等生物活性物质，具有抗细菌、真菌等功能。罗楚平等［3］报道枯草芽孢杆菌916产生的bacillomycin L能使病原真菌菌丝发生畸形和抑制真菌孢子萌发。F1-1的脂肽类化合物提取物对辣椒疫霉菌表现出较好的抑制效果，在F1-1的基因组中检测到了surfactins、fengycins、iturins三大家簇的多种脂肽类化合物相关合成基因的存在，表明产生脂肽类化合物是F1-1对辣椒疫霉菌发挥抑制效果的重要因素。生防菌对土传病害的防控机制存在多样性、协同性、综合性，其作用机理可能涉及定殖、抑菌、抗性诱导等多个方面［26，27］。本试验发现不同芽孢杆菌菌株之间的抑菌能力和生防效果存在差异，其相关机理还有待进一步研究。

已有的研究结果表明，一些芽孢杆菌可以作为植物根际促生菌促进作物的生长发育。娄义等［28］证明芽孢杆菌Bs10、Ba12和Bl10能明显促进番茄的胚轴、胚根和植株的生长；杨定祥等［20］证明，用来自海洋的解淀粉芽孢杆菌SH-27发酵液处理辣椒，能显著增加植株的根长、株高、茎粗、鲜质量和干质量。在本试验中，F1-1的发酵液可显著增加辣椒苗的株高、茎粗、全株鲜质量、全株干质量和壮苗指数，这对于调节苗期辣椒适应设施栽培条件、增强对病害的抵抗能力具有一定的意义。

综上所述，F1-1可以作为优良的生防菌株资源，用以开发兼具防治病害和壮苗促生功效的生防菌剂，实现替代或部分替代化学药剂进行辣椒疫病等设施蔬菜土传病害的防治，以达到减量用药的目的，推动设施蔬菜病害绿色防控的发展。