浊点萃取-气相色谱法同时测定6种有机磷农药

谢美仪， 姜 勋， 刘炜婷， 郝晓棠， 刘甜恬， 郑 涵， 王 梅

(广东药科大学公共卫生学院，广东广州 510310)

我国是农业大国，为防治病虫害，使用农药是提高粮食产量的重要手段。有机磷农药(Organophosphorus Pesticides，OPPs)因防治对象多而被广泛应用，但由于长期大量施用，OPPs残留问题日益严重，残留在环境中的OPPs会通过水、空气、食物等途径影响人体健康[1-3]。OPPs与生物体内的胆碱酯酶结合，造成乙酰胆碱积累，使人出现中毒症状，并且长期接触OPPs会破坏人体的生殖系统和内分泌系统，产生无法逆转的损害。因此，建立环境中OPPs残留的快速、灵敏的测定方法非常有必要。

OPPs大多具有挥发性和良好的热稳定性，气相色谱法(GC)对于OPPs的分离测定有着显著的优越性，同时火焰光度检测器(FPD)可选择性和敏感地检测有机磷化合物，因此GC-FPD被广泛应用于OPPs的检测中。但实际样品中OPPs的含量常在痕量水平，且环境基质复杂，因此样品需要前处理后才能准确测定。传统的前处理技术如液-液萃取和固相萃取可以分离富集OPPs，但存在有机溶剂用量大，毒性高的问题。浊点萃取(CPE)用低毒的表面活性剂做萃取剂，可以大幅度减少有机溶剂的使用，实现对基质复杂的环境样品中OPPs的分离富集。

本实验选择6种极性不同的OPPs为研究对象，优选聚乙二醇6000为萃取剂，通过加入无机盐降低浊点温度，在室温下完成萃取。使用乙酸乙酯和正己烷混合溶剂对富集相进行反萃取，减弱了单一溶剂萃取时对极性的限制，在超声辅助下，目标物进入有机相中，并注入GC仪检测，成功建立CPE-GC联用方法对6种OPPs的测定，并应用于实际环境水样和土壤中OPPs残留的检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

GC-2010气相色谱仪(日本，岛津)，附FPD检测器。

标准品：敌敌畏(Dichlorvos，美国Sigma-Aldrich)；毒死蜱(Chlorpyrifos)、甲基对硫磷(Methyl Parathion)、二嗪磷(Diazinon)、乐果(Dimethoate)、马拉硫磷(Malathion)均来源于德国Dr.Ehrenstorfer公司。有机磷农药标准储备溶液：准确称量6种OPPs各10.00 mg，用甲醇溶解定容，使终浓度为1.0 g/L。标准工作溶液：用甲醇稀释6种有机磷农药储备液至50～100 mg/L。于4 ℃保存以上储备溶液与工作溶液，每10 d新制标准工作溶液。聚乙二醇6000(PEG 6000，美国Sigma-Aldrich)；丙酮、乙酸乙酯、正己烷均为分析纯(天津市百世化工有限公司)；异辛烷(分析纯，德国Dr.Ehrenstorfer)。水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

RTX-1701型毛细管柱色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Restek)。设定进样口温度为240 ℃，检测器温度为250 ℃，载气为高纯氮，流速1.0 mL/min，进样量1 μL。程序升温：150 ℃(保持0.5 min)，以20 ℃/min升至185 ℃(保持2 min)，以20 ℃/min升至200 ℃(保持5 min)，以30 ℃/min升至230 ℃(保持3 min)；分流比为10∶1。

1.3 环境样品的采集和保存

分别采集1 L的自来水水样及河道水样，水样用0.45 μm水系滤膜过滤除渣，4 ℃冰箱避光保存，尽快测定。土壤样品采集后带回实验室立即进行风干、研细、过筛并采用四分法取样。

1.4 浊点萃取过程

于15 mL尖底塑料离心管中，依次加入1 mL pH=6.0的磷酸盐缓冲溶液，0.60 g PEG 6000和1.0 mol/L 的无水Na2SO4，随后加入一定量标准工作溶液或样品溶液(8 mL环境水样/2 g土壤样品)，用超纯水定容至10 mL，振荡摇匀5 min，3 500 r/min离心3 min。吸弃下层水相后，在富集相中加入300 μL乙酸乙酯∶正己烷混合液(65∶35,V/V)。超声反萃取20 min，离心1 min后，取上层有机相上机测定。

2 结果与讨论

2.1 缓冲溶液pH的优化

甲基对硫磷和乐果在碱性溶液中会水解[13]，不能被疏水性胶束萃取，因此本实验考察了pH在3.0～8.0的范围内对萃取效果的影响，见图1。结果表明，随着溶液pH增大，除乐果外其余5种OPPs的峰面积均呈逐渐上升的趋势，在pH=6.0时萃取效果最佳。而乐果受pH的影响较小，峰面积随着pH的增大呈缓慢增大，在pH=7.0时达到最佳并保持稳定。因此，缓冲溶液pH选定为6.0。

图1 pH对萃取效果的影响Fig.1 Effect of pH on extraction efficiency

2.2 表面活性剂的优化

通过对表面活性剂种类的考察，发现CPE中常用表面活性剂Triton X-114的萃取效果不佳，而两端亲水的PEG 6000对微溶于水的OPPs萃取效果更好，同时由于盐析的辅助作用更利于OPPs被萃取到富集相中。因此，选择PEG 6000作为萃取剂。在Na2SO4的加入量为2 g的条件下，实验考察3%～8%PEG 6000对6种OPPs的萃取效果的影响，结果如图2所示。当PEG 6000浓度为6%时，除乐果外其余5种目标物的峰面积达到最高。乐果峰面积整体呈些许下降趋势。综合考虑，选择PEG 6000的最佳浓度为6%。

图2 PEG 6000浓度对萃取效果的影响Fig.2 Effect of PEG 6000 concentration on extraction efficiency

2.3 电解质的选择与优化

无机电解质的加入可降低PEG 6000的浊点温度(CPT>100 ℃)，并且通过盐析作用可提高目标物的萃取效果。实验选择加入Na2SO4来降低PEG 6000的浊点温度。加入0.8 mol/L Na2SO4和6%PEG 6000即可在常温下产生浊点现象。因此实验研究了0.8～1.6 mol/L Na2SO4对萃取效果的影响，结果如图3所示。实验发现，除乐果外其余5种分析物浓度大于1.0 mol/L后峰面积变化不大；乐果峰面积在考察浓度范围平稳，故实验选择Na2SO4浓度为1.0 mol/L。

图3 无水NaSO4浓度对萃取效果的影响Fig.3 Effect of Na2SO4 concentration on extraction efficiency

2.4 反萃取剂的选择与优化

反萃取剂的选择是实现CPE与GC联用的关键。选取的有机溶剂需满足以下两点：一要与PEG 6000不互溶，二要对目标物有良好的溶解性。同时基于与GC的良好适配性考虑，实验选取了不同极性的乙酸乙酯、正己烷和异辛烷作反萃取剂，考察了这3种有机溶剂对OPPs萃取的效果(图4)。实验发现，乙酸乙酯对甲基对硫磷、马拉硫磷、敌敌畏、乐果的萃取效果明显优于正己烷和异辛烷，但正己烷对二嗪磷和乐果的萃取能力要明显高于乙酸乙酯和异辛烷。为兼顾目标物的极性，分别将极性较小的乙酸乙酯与极性大的正己烷和异辛烷进行1∶1混合萃取，结果发现对其中5种目标物的萃取效果均升高，乙酸乙酯与正己烷混合萃取时的效果更佳。于是进一步探讨乙酸乙酯与正己烷的配比以使萃取效果达到最优，结果如图5所示。最终优选乙酸乙酯与正己烷的配比为65∶35。实验探讨了乙酸乙酯∶正己烷混合液(65∶35)用量在100～600 μL范围对6种OPPs萃取的影响，经按有机相体积折算，比较粗萃取率后，最终选择加入300 μL有机溶剂进行后续研究。

图4 反萃取剂种类对萃取效果的影响Fig.4 Effect of back extractant type on extraction efficiencyA:Ethyl acetate;B:Isooctane;C:n -hexane.

图5 乙酸乙酯含量对萃取效果的影响Fig.5 Effect of ethyl acetate content on extraction efficiency

2.5 超声时间的优化

实验考察了超声时间在5～30 min范围内对6种OPPs萃取的影响。当超声时间在5～20 min时，随着超声时间的增加，除乐果外其余5种OPPs的峰面积均出现不同程度的增大，并在20 min的超声时间达到最大。而乐果的峰面积受超声时间影响较小。因此，选择20 min的超声时间进行后续研究。

2.6 摇匀和离心时间的优化

实验过程中，将溶液振荡一定时间以利于胶束捕获疏水性目标物进入富集相中。实验考察了摇匀时间在3～20 min对6种OPPs萃取的影响。结果显示：当摇匀时间为5 min时，6种分析物的峰面积即达到最大，之后峰面积保持稳定不变。因此摇匀时间选择5 min。

本方法中共有两次离心，第一次是在CPE中，为加速水相与富集相的分离。考察了第一次离心时间在1～8 min内对萃取的影响，发现各目标物峰面积无明显变化，为保证分相充分，选择3 min为第一次离心时间。在反萃取过程中，有机溶剂和富集相分离后，仍有部分溶液在管壁上残留，为使有机相更加澄清透明，对溶液进行第二次离心。实验发现，1 min的离心时间已足够使有机相澄清透明。

2.7 方法学特征

在最优的实验条件下，对方法的线性范围、检出限(LOD)、富集倍数等指标进行评价，LOD由3倍信噪比(S/N)计算，富集倍数=萃取后工作曲线斜率/萃取前工作曲线斜率；同时为考察方法精密度，对6种OPPs在50～100 μg/L浓度范围内的混标进行6次平行萃取测定，结果见表1。方法LOD为0.8～5.0 μg/L，除乐果外其余5种OPPs的富集倍数≥16.4，而乐果的富集倍数为5.48，相对标准偏差(RSD)在3.38%～5.18%范围内，适用于痕量OPPs的定量分析。

表1 有机磷农药的分析特征Table 1 Analysis characteristics of organophosphorus pesticides

2.8 环境样品检测

将建立的方法应用于测定环境水样和土壤样品中OPPs含量，并进行加标回收实验(表2)。结果显示，在水样2、3和土壤样品1、3中检测到敌敌畏，浓度为12.4～23.3 μg/L，水样2、3中检测到毒死蜱，浓度为30.6～85.4 μg/L。样品的加标回收率在89.7%～109.9%之间，表明方法的准确性和实用性较好。

表2 环境样品分析结果和加标回收率Table 2 Environmental samples analysis results and recoveries

3 结论

本文建立了CPE结合GC-FPD法测定环境水样和土壤中6种极性各异的OPPs残留的方法，通过进行反萃取，成功将富集相中的目标物萃取到有机溶剂中，解决了CPE与GC联用时堵塞进样孔的问题。通过对乙酸乙酯、异辛烷和正己烷三种有机溶剂的优选，最终使用少量的反萃取剂(体积比65∶35的乙酸乙酯∶正己烷混合溶剂)即可达到完全去除上机样品中表面活性剂的效果，并且兼顾了对极性差异较大的分析物同时进行分离富集的目的。本文建立的方法适用于环境水样和土壤中OPPs的测定，尤其适用于对极性差异较大样品的检测。