甜瓜粉霉病病原菌生物学特性及其寄主范围测定

王军节　赵鲁迺克　范春霞　张琇　王鹏　穆风花

摘    要：为明确甜瓜粉霉病菌（Trichothecium roseum）生物学特性和寄主范围，研究了不同营养和环境条件对甜瓜粉霉病菌菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响，并采用损伤接种法测定病菌在室内条件下对寄主的致病性。研究结果表明，甜瓜粉霉病菌菌丝最适生长条件为PDA、PDA+CMF或PSA培养基，果胶为碳源，甘氨酸或牛肉膏为氮源，温度28 ℃，pH 5.0～9.0，全黑暗培养;最佳产孢条件为PDA培养基，果胶为碳源，牛肉膏为氮源，温度22～28 ℃，pH 7.0，全黑暗或光暗交替培养;孢子最佳萌发条件为温度28 ℃，pH 7.0，全黑暗高湿环境培养。此外，甜瓜粉霉病菌可侵染玉金香甜瓜、早酥梨、富士苹果、金冠苹果和AC番茄，但不能侵染金橘和紅地球葡萄。生物学特性和寄主范围研究结果可为综合防治采后粉霉病提供科学依据。

关键词：厚皮甜瓜;粉霉病;粉红单端孢;生物学特性;寄主范围

中图分类号：S635.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）10-020-06

Biological characteristics and host range of the pathogen causing pink rot of muskmelon

WANG Junjie， ZHAO Lunaike， FAN Chunxia， ZHANG Xiu， WANG Peng， MU Fenghua

（Ningxia Key Laboratory for the Development and Application of Microbial Resources in Extreme Environments/College of Biological Science and Engineering， North Minzu University， Yinchuan 750021， Ningxia， China）

Abstract： In order to determine the biological characteristics and host range of Trichothecium roseum， which is the pathogen of pink rot in muskmelon fruit， the effects of different nutritional and environmental conditions on mycelial growth， sporulation and conidial germination of the pathogen were studied. Meanwhile， the pathogenicity of T. roseum to hosts in indoor conditions was determined by the methodology of injury inoculation. The results of biological characteristics showed that the most suitable growth conditions for the pathogen were PDA， PDA+CMF or PSA medium， pectin as carbon source， glycine or beef extract as nitrogen source， 28 ℃， pH 5.0-9.0 and culture in total darkness; the best sporulation conditions were PDA medium， pectin as carbon source， beef extract as nitrogen source， 22-28 ℃， pH 7.0 and culture in total darkness or in alternating light and darkness; the favorable condition for conidia germination were 28 ℃， pH 7.0， high humidity and culture in total darkness. Furthermore， the pathogen could infect Yujinxiang muskmelon， Zaosu pear， Red Fuji apple， Golden Delicious apple and Ailsa Craig tomato except kumquat and Red Globe grape. These results provide basis to integrated control pink rot after harvest.

Key words： Muskmelon; Pink rot; Trichothecium roseum; Biological characteristics; Host range

厚皮甜瓜是我国西北地区重要的瓜菜类经济作物，因其果实采收季节温度高以及冷链措施不完整极易造成采后烂损，给产业带来严重经济损失[1-2]。研究表明，粉红单端孢（Trichothecium roseum）侵染引起的粉霉病为甜瓜果实采后主要病害[3-6]，该病菌侵染还有产生单端孢菌毒素的风险[7-8]，给鲜果及其加工品带来安全隐患。因此，控制甜瓜果实粉霉病发生有利于当地产业发展。虽有研究报道了寄主为枣果实[9]和甜瓜果实[3]T. roseum的生物学特性，但通过营养因子和环境因子开展T. roseum的生物学特性及其寄主范围的研究鲜见报道。笔者以前期鉴定的宁夏半干旱地区甜瓜粉霉病菌（T. roseum）为研究对象，研究培养基、碳源和氮源等营养条件以及温度、pH值、光照与湿度等环境因素对该病菌生长的影响，同时测定该菌对玉金香甜瓜、富士苹果、金冠苹果、早酥梨、金橘、AC番茄和红地球葡萄等7种不同水果的致病性，为明确甜瓜粉霉病菌生物学特性以及后期开展粉霉病防控技术研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2019年8—10月于北方民族大学植物性农产品贮藏与加工重点实验室进行。

1.1.1 供试菌株 粉红单端孢（T. roseum） LC-1701菌株由北方民族大学植物性农产品贮藏与加工重点实验室分离并保存，于2019年8月取出活化备用[4]。

1.1.2 供试培养基 水琼脂培养基（WA，琼脂15 g）、马铃薯葡萄糖培养基（PDA，马铃薯：200 g;葡萄糖：20 g;琼脂：15 g）、马铃薯蔗糖培养基（PSA，马铃薯：200 g;蔗糖：20 g;琼脂：15 g）、200 g·L-1甜瓜果实煎汁培养基（CMF，甜瓜鲜果肉：200 g;琼脂：15 g）、PDA+200 g·L-1甜瓜果实煎汁培养基（PDA+CMF）、査氏培养基（Czapeks，K2HPO4：1 g;KCl：0.5 g;MgSO4：0.5 g;FeSO4：0.01 g;NaNO3：3 g;蔗糖：30 g;琼脂：15 g）、麦芽汁琼脂培养基（MEA，麦芽糖：20 g;琼脂：15 g），上述各培养基均分别用蒸馏水定容至1 L，备好后121 ℃湿热灭菌20 min[10]。

1.1.3 供试寄主 玉金香甜瓜（Cucumis melo L. cv. ‘Yujinxiang）采购自宁夏中卫市兴仁镇甜瓜种植农田;富士苹果（Malus domestica ‘Red Fuji）、金冠苹果（Malus domestica ‘Golden Delicious）、早酥梨（Pyrus bretchneideri ‘Zaosu）、金橘（Fortunella margarita ‘Swingle）、红地球葡萄（Vitis vinifera ‘Red Globe）和AC番茄（Solanum lycopersicum ‘Ailsa Craig）采购自宁夏银川市西夏区同心路综合市场。

1.2 方法

1.2.1 培养基类型对病原菌生长和产孢的影响 将8 mm的菌饼接种于WA、PDA、PSA、CMF、PDA+CMF、Czapeks和MEA 7种培养基平板中央，于黑暗条件28 ℃、90%RH恒温培养5 d。采用十字交叉法用游标卡尺测定菌落直径，血球计数板法测定孢子浓度[11]。每处理5次重复。

1.2.2 营养条件对病原菌生长和产孢的影响 以Czapeks培养基为基础培养基，以等质量的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖、果胶、可溶性淀粉、甘油和甘露醇为碳源;以等质量的磷酸铵、硫酸铵、牛肉膏、氯化铵、甘氨酸、尿素、蛋白胨和酵母粉作为氮源;以不加碳源、氮源为对照[12]。其余方法同1.2.1。

1.2.3 环境条件对病原菌生长、产孢和孢子萌发的影响 使用PDA培养基测定不同温度（4、10、16、22、28、34、40 ℃于pH 7.0、黑暗培养）、pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0于28 ℃、黑暗培养）和光照（连续光照、12 h光暗交替、连续黑暗于pH 7.0、28 ℃培养）[13]等环境条件对菌落生长和产孢的影响，菌丝生长及产孢方法同1.2.1。将WA培养基中接入100 μL 1×106个·mL-1孢子，放置于不同培养条件中培养4 h后，镜检孢子萌发情况并根据公式计算孢子萌发率，每處理5个视野，每视野200个孢子[14]。

孢子萌发率/%=（萌发孢子数/观察孢子总数）×100。

1.2.4 相对湿度对病原菌孢子萌发的影响 利用不同的饱和盐溶液将相对湿度分别设置为23%RH（CH3COOK）、33%RH（MgCl2）、43%RH（K2CO3）、53%RH（Mg（NO3）2）、65%RH（CoCl2）、75%RH（NaCl）、84%RH（KCl）、93%RH（KNO3）[7]。取浓度为1×106个·mL-1的分生孢子悬浮液20 μL，涂布在15 g·L-1琼脂载玻片上，放置于上述不同相对湿度的密闭黑暗环境中28 ℃培养12 h，测定孢子萌发情况[15]，同1.2.3。

1.2.5 病原菌寄主范围测定 参考郝晓娟等[16]方法，采用损伤接种来对病菌致病性进行测定。取大小和成熟度一致的玉金香甜瓜、富士苹果、金冠苹果、早酥梨、金橘、红地球葡萄及AC番茄果实，用75%酒精表面消毒。无菌环境下于赤道部位均匀打4个3 mm深的接种点，静置20 min后接种10 μL 1×106个·mL-1孢子悬浮液，以无菌水作对照。接种后果实密封于保鲜盒中，25 ℃ 60%～70%RH培养，统计发病率并测定菌落直径，每处理5个果实，3次重复。

1.3 数据分析

试验数据利用SPSS 19.0软件进行统计分析，利用单因素方差分析比较差异显著性，用Excel 2016制作图表。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对菌丝生长和产孢的影响

由表1可知，甜瓜粉霉病菌在不同供试培养基上均可生长，其中，病原菌在PDA、PDA+CMF和PSA培养基上生长最快，菌落直径均在71.00 mm以上;病原菌在CMF培养基中生长较好，在Czapeks和MEA培养基中生长较差;病原菌在WA培养基上生长最差，菌落直径仅为9.88 mm。病原菌在PDA培养基中产孢量最高，为231.67×106个·mL-1;WA、CMF、Czapeks和MEA培养基产孢量最低。因此，PDA、PDA+CMF和PSA培养基有利于甜瓜粉霉病菌菌丝生长，而PDA培养基更利于该菌产孢。

2.2 碳、氮源对菌丝生长和产孢的影响

甜瓜粉霉病菌能在各种碳、氮源上生长，但不同碳、氮源之间生长存在差异（表2）。其病原菌在果胶为碳源上生长最好，菌落直径为57.29 mm;以葡萄糖和麦芽糖为碳源时菌丝生长较好，菌落直径均在22.00 mm以上;以果糖、淀粉、甘油和甘露醇为碳源时菌丝生长较为缓慢;以蔗糖和乳糖为碳源时菌丝生长较差，菌落直径均在14.00 mm以下。病原菌在果胶中产孢量最大，为98.00×106个·mL-1;在其余实验用碳源中产孢量均低于14.00×106个·mL-1。由此可知，果胶作为碳源时最利于病原菌的菌丝生长和产孢。当氮源为甘氨酸和牛肉膏时病原菌菌丝生长最好，菌落直径均在53.50 mm以上;以硫酸铵、氯化铵、尿素和蛋白胨为氮源时菌丝生长较好，菌落直径在25.00～43.00 mm之间;以硝酸钠、磷酸铵和酵母粉为氮源时菌丝生长最差，菌落直径均低于19.00 mm。病原菌在牛肉膏为氮源时产孢量最多，为93.75×106个·mL-1;甘氨酸和蛋白胨为氮源时产孢量较多，在34.00～59.00×106个·mL-1之间;以硝酸钠、磷酸铵、硫酸铵、尿素、氯化铵和酵母粉为氮源时产孢量最少，仅为2.00×106～11.00×106个·mL-1。因此，甘氨酸和牛肉膏为氮源时有利于病原菌菌丝生长，牛肉膏为氮源时有利于该菌产孢。

2.3 溫度对病原菌的菌丝生长、产孢及分生孢子萌发的影响

由图1可知，病原菌对温度的适应范围较广，菌丝在4～40 ℃内均可生长与产孢。在4～28 ℃内菌丝生长速度及产孢量随温度升高逐渐升高;28～40 ℃内菌丝生长速度与产孢量随温度升高逐渐降低。菌丝最适生长温度为28 ℃，菌落直径为68.14 mm，最适产孢温度为22～28 ℃，产孢量均高于205.00×106个·mL-1，温度低于4 ℃或高于40 ℃菌丝生长和产孢受到严重抑制。病原菌孢子在4～40 ℃内均可萌发，孢子萌发率在4～28 ℃内随温度的升高而升高，而在28～40 ℃内随温度的升高而下降，最适孢子萌发温度为28 ℃，孢子萌发率达82.67%。

2.4 pH对病原菌的菌丝生长、产孢及分生孢子萌发的影响

病原菌对酸碱适应范围较广，pH为3.0～11.0之间病原菌均可生长和产孢，且孢子可以萌发（图2）。菌丝生长、产孢量和孢子萌发率在pH为3.0～7.0内均随pH的升高逐渐升高，而在pH为7.0～11.0内随pH的升高逐渐下降。最适宜菌丝生长的pH为5.0～9.0，菌落直径均在34.00～44.00 mm之间;最适宜病原菌产孢和孢子萌发的pH为7.0，产孢量和孢子萌发率分别为174.17×106个·mL-1和98.23%。

2.5 光照条件对病原菌的菌丝生长、产孢及分生孢子萌发的影响

不同光照处理对甜瓜粉霉病菌菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响如图3所示。全黑暗条件下培养有利于菌丝生长和分生孢子萌发，此时菌落直径和孢子萌发率分别为76.15 mm和84.08%;全黑暗和光暗交替条件下培养有利于病原菌产孢，产孢量均在240.00×106个·mL-1以上。

2.6 相对湿度对病原菌孢子萌发的影响

不同湿度对病原菌孢子萌发具有一定的影响（图4）。在23%～93%RH之内，湿度越大越有利于病原菌的孢子萌发。当低于53%RH时，分生孢子萌发率小于12.00%;高于73%RH时孢子萌发率大于65.00%。当相对湿度为93%RH时，孢子萌发率达到最大值90.95%。

2.7 病原菌寄主范围测定

甜瓜粉霉病菌可以侵染玉金香甜瓜、早酥梨、富士苹果、金冠苹果以及AC番茄，不能侵染金橘和红地球葡萄（图5-A）。接种甜瓜粉霉病菌，早酥梨和富士苹果3 d时开始发病，玉金香甜瓜和金冠苹果5 d时开始发病，AC番茄6 d时开始发病。接种后6 d时，玉金香甜瓜、早酥梨和富士苹果产生典型的粉霉病症状，其中玉金香甜瓜病斑直径最大为（34.23±0.69）mm，早酥梨病斑直径较大为（9.89±1.30）mm，富士苹果较大为（5.08±0.27）mm，金冠苹果较小为（3.03±1.33）mm，AC番茄最小为（1.38±0.97）mm（图5-B）。病菌对玉金香甜瓜致病力最强，对AC番茄致病力最弱。接种后6 d，金橘的接种部位未见任何症状，而红地球葡萄接种点虽有发黑现象，但果实未见坏死腐烂，更未见粉红色菌丝霉层，对发黑组织进行再分离，未分离到粉霉病菌，径剖检发现接种部位果肉完好。

3 讨论与结论

由生物学特性研究结果可知，甜瓜粉霉病菌在PDA和PDA+CFA上生长最快;在温度为28 ℃、pH 5.0～9.0和全黑暗条件下最适菌丝生长;在22～28 ℃、pH 7.0、全黑暗和光暗交替条件下最适产孢;在28 ℃、pH 7.0、全黑暗的高湿环境条件下最适宜孢子萌发。这与张忠明[3]等的研究结果一致，而与何石兰等[17]与王勇等[18]结果略有差异，可能是由于不同地理环境和不同宿主上的T. roseum的生物学特性存在差异所致。研究结果还表明，果胶为病菌菌丝生长和产孢的最适碳源，因此生长及采后环节中应当避免各种损伤造成的细胞壁果胶成分暴露;病原菌在硝酸钠和磷酸铵氮源上生长较差，因此果实生长期间可优选硝酸钠和磷酸铵作为肥料。

寄主范围测定结果显示，甜瓜粉霉病菌对玉金香甜瓜、早酥梨、金冠和富士苹果、AC番茄、金橘和红地球葡萄等果实致病力不同，这可能与接种时果实pH环境的差异有关。Prusky等[19]根据病原菌调控适宜自身侵染酸碱环境的能力可分为碱化菌和酸化菌，王振宇等[20]研究发现，甜瓜粉霉病病菌属于碱化菌，可以解释试验中T. roseum对金冠苹果（pH 3.74±0.01）、富士苹果（pH 3.89±0.02）、早酥梨（pH 4.59±0.00）和玉金香甜瓜（pH 4.93±0.46）4种水果侵染能力增加的原因。金橘的pH为2.54±0.003，经损伤接种后并未发病，与本试验中测得的该菌pH低于3.0时无法生长的结果相一致。AC番茄（pH 4.5±0.003）与红地球葡萄（pH 4.13±0.002）的pH值相近，且均在适宜T. roseum生长的pH范围内，然而损伤接种后AC番茄发病而红地球葡萄未发病，这表明除了酸碱环境影响病原菌的致病力外，还可能存在其他致病机制及其影响因素，但这些复杂的互作机制有待进一步深入研究。

甜瓜粉霉病菌体外培养适宜在高温高湿、pH 7.0和全黑暗条件下生长、产孢和孢子萌发，适当降低甜瓜的贮藏温度和湿度可以减少甜瓜贮藏期间病害的发生。当果胶为碳源时病菌生长最好，应减少甜瓜果实的机械损伤。病菌可侵染玉金香甜瓜、早酥梨、金冠苹果、富士苹果和AC番茄，因此果实贮藏期间应采取措施避免污染。

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