上海动物园流浪猫弓形虫感染情况调查

朱九超 虞坚颐 白艺兰 周立晨 孙泉云 赵洪进*

(1.上海市动物疫病预防控制中心，上海，201103；2.上海动物园，上海，200335)

弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的一种全球范围内流行的人兽共患寄生虫病[1]。刚地弓形虫是机会性致病寄生虫，能感染包括人类在内的几乎所有温血动物，多数人与动物在感染后无显著症状，但对于免疫功能低下或受限人群以及先天感染的婴儿，感染易导致严重疾病甚至致命[2]。包括家猫(Felissilvestriscatus)在内的猫科(Felidae)动物是刚地弓形虫的唯一终末宿主，它们通过摄入缓殖子、速殖子或卵囊感染，又通过粪便排出卵囊污染环境和水体，成熟卵囊被其他动物摄入后引起感染[3]，是弓形虫传播中最重要的一环。

针对多地动物园的研究发现，多种圈养野生动物会感染弓形虫，其中猫科动物与其他动物相比有更高的感染率[4]。张述义等[5]曾对上海动物园52种117只圈养野生动物开展过血清弓形虫抗体检测，总体阳性率37.7%(ELISA法)，研究发现食肉类(Carnivora)动物(尤其是猫科动物)弓形虫感染率在各组动物大类中最高。该研究还发现1例新近感染的赤猴(Erythrocebuspatas)病例，推测其可能是因摄入环境中的弓形虫卵囊而发病。虽然动物园环境中的流浪猫被认为是造成圈养猫科动物及其他易感动物感染的最主要传播途径之一[6]，但同类研究中仅涉及少量流浪猫样本，亦或主要针对家养环境中的宠物猫，有关动物园园区内流浪猫弓形虫感染状况的监测研究较少。本研究通过对上海动物园园区内流浪猫开展弓形虫抗体和病原检测，旨在摸清园区内弓形虫感染情况和潜在风险，为园区弓形虫病防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2019年11月—2020年5月，在上海动物园内流浪猫频繁活动觅食区域设诱捕笼点，捕获流浪猫103只。每只静脉采集血液样本2—4 mL，全血保存于-80℃，备测。3 500 r/min离心10 min分离得血清，保存于-20℃，备测。

1.2 检测方法

采用磁珠法(MagMAXTMMicrobiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit)于全自动工作平台(KingFisher Duo Prime)提取全血样本核酸，采用实时荧光PCR法检测弓形虫B1基因特异性片段，试剂盒购自广州维伯鑫生物科技有限公司，检测方法与结果判定均按试剂盒操作说明施行，简述如下：将试剂盒置室温使荧光PCR预混液、阴性对照和阳性对照完全溶解，并混匀。取20 μL荧光PCR预混液和1 μLTaq酶至每个反应管内，然后加入提取好的病毒核酸、阴性对照、阳性对照各4 μL，每个反应总体积为25 μL。按以下反应条件进行设置：95℃ 10 min；94℃ 15 s；55℃ 30 s(收集荧光)；40个循环。

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清样本中的弓形虫抗体IgG，弓形虫抗体检测试剂盒购自法国爱迪威(IDVET)公司，检测方法与结果判定均按试剂盒操作说明施行，简述如下：取10 μL待测样本、阴性对照和阳性对照，分别加入96孔检测板对应位置；每孔加入90 μL Diltion Buffer 2进行稀释；室温孵育45 min后甩干，用配置好的wash solution清洗3次；分别加入100 μL配制好的conjugate工作液；室温孵育30 min后甩干检测板，用配置好的wash solution清洗3次；分别加入100 μL substrate solution，室温环境下避光孵育15 min；再分别加入100 μL终止液，并立即于450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。

1.3 数据分析

使用SPSS 26.0对数据进行分析，采用非参检验(Kruskal-Wallis)对不同区域、不同采样季节流浪猫感染率差异进行比较。

2 结果与分析

2.1 弓形虫分子生物学检测

对采集的103份血液核酸样本采用实时荧光PCR扩增弓形虫B1基因特异性片段，结果均为阴性。

2.2 血清弓形虫抗体IgG检测

对其中有效的95份血清样本进行弓形虫抗体IgG检测，结果得阳性样本49份，总体阳性率51.6%，公园各区域流浪猫阳性率与S/P值见表1。

表1 上海动物园流浪猫弓形虫血清抗体检测结果Tab.1 Seroprevalences of antibody to Toxoplasma gondii of feral cats in Shanghai Zoo

2.3 区域和采样月份对流浪猫血清抗体S/P值的影响

采用K-W检验发现，上述不同的8个区域间流浪猫血清抗体S/P值无显著差异(P=0.555)，不同月份间(11—5月)流浪猫血清抗体S/P值(表2)无显著差异(P=0.903)。

表2 上海动物园流浪猫不同月份弓形虫血清抗体S/P值Tab.2 S/P values of sero antibody to Toxoplasma gondii of feral cats in Shanghai Zoo in different months

3 结论与讨论

本研究共检测上海动物园流浪猫103只，血液核酸样本未检出弓形虫抗原。95份血清样本检出弓形虫IgG抗体49份，总体阳性率51.6%，明显高于相关研究中我国城市宠物猫(如深圳市4.68%[7]、上海市14.5%[8])、美国动物园(29.4%)[6]和土耳其伊兹密尔(35.6%)[9]。阳性率最高区域为灵长动物区(83.3%)，最低为两栖爬行类区与兽医院(40.0%)，不同区域、不同月份间流浪猫血清抗体S/P值差异未达显著水平。

猫科动物是弓形虫的终末宿主，是弓形虫传染链中的最主要源头，在弓形虫感染状况监测与防控中应当作为重要指示物种[4]。因为有良好的环境、稳定的食物来源，且人类干扰少，流浪猫易在动物园聚集和繁衍。本研究动物园流浪猫抗体阳性率在区域和时间上均无显著差异整体趋同，反映猫科动物虽为独居动物，有相对固定的活动范围，但在本园区流浪猫个体间弓形虫有较高的传播效率。圈养野生动物相关研究显示，灵长目中新大陆猴类如松鼠猴(Saimirisciureus)、狐猴类如环尾狐猴(Lemurcatta)均是弓形虫高度易感物种[10-11]，染病的澳洲有袋目(Marsupialia)动物也有较高的致死率[12]。环尾狐猴母体的弓形虫经由胎盘组织感染胎儿，导致先天性感染和死胎[13]，国内广州动物园也有环尾狐猴感染弓形虫死亡的报告[14]。我国江西省内动物园7种39只圈养动物检出弓形虫血清抗体总阳性率为17.9%(IHA法)，包括长颈鹿(Giraffacamelopardalis，27.3%)、小天鹅(Cygnuscolumbianus，22.2%)和狼(Canislupuslaniger，20.0%)等[15]。福州动物园27种110只动物中检出15种动物血清抗体阳性(MAT法)，总阳性率22.7%[16]。上述研究表明，圈养野生动物因其生活环境与饲养方式，极易暴露于弓形虫传染链中，成为易感群体[17]。本研究中灵长区流浪猫抗体阳性率与S/P均值均在各区域中最高(83.3%、88.4%)，提示其传播弓形虫的风险较高，这些流浪猫在各个展区间活动，对开放/半开放展区中的圈养动物极易引起感染风险，应当引起重视。

在动物园环境中弓形虫病传染源、传染途径多，易感物种种类繁多。动物园又是一个人类、圈养动物、野生动物交互频繁的地区，在这样的场所开展弓形虫病防控必须掌握传播源头与传播链，明确群体感染状况，因此对流浪猫、圈养猫科动物等重要指示性动物开展持续性常态化监测，将为弓形虫病在圈养野生动物中的防控提供科学依据。