聚乙烯醇/聚苹果酸复合水凝胶的制备及性能研究*

2021-11-13马争发谭维群余甜甜崔世煜廖秋香张丽杰

功能材料 2021年10期

马争发,谭维群,余甜甜,崔世煜,廖秋香,张丽杰

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

0 引言

水凝胶是高分子间通过共价键、氢键或范德华力等作用相互交联而形成的一种三维网状材料，能够在水中溶胀、吸收并保持大量水分而又不溶解于水[1-3]，具有良好的生物相容性、保湿性和易修饰性[4-6]。水凝胶被广泛应用于生物医药领域，如创伤敷料[7]，组织工程支架[8-9]，药物缓释载体[10]等。PVA(聚乙烯醇)由VAc(醋酸乙烯)经聚合醇解而制成的水溶性高分子材料，具有良好的成膜性、力学性能、降解性和安全性，且制备方法简单重复性好，是合成水凝胶敷料的主要原料之一。但单一PVA合成的水凝胶通常无生物活性，在生物医学方面存在缺陷，极大的限制了其推广应用。通常与其他材料一起制备复合水凝胶以满足各方面的需求。PMLA(聚苹果酸)是唯一一种含酯键又能快速水解的高分子聚合物，水解产物为苹果酸单体，可进入三羧酸循环中被降解。同时其分子结构上含有很水溶性、血液稳定性和抑菌性等[11-13]，被广泛应用于药物载体等领域，但在生物多化学性能活泼的羧基，这些游离的羧基赋予PMLA良好的修饰性、生物相容性、医用敷料中尚未见使用。伤口的愈合是一个缓慢的过程，众多的外界因素会导致其愈合缓慢，其中细菌感染就最常见的因素。在伤口愈合过程中如果产生感染细菌，就会引起伤口化脓，导致伤口愈合时间延长，严重的甚至会引起脓毒血症，危害生命健康。因此，敷料具有抑菌性是非常有必要的。课题组在实验中发现，加入聚苹果酸的敷料，具有良好的抑菌效果，因此本文通过将PMLA和PVA共混改性，采用冻融法制备出PVA/PMLA复合水凝胶，探究了复合水凝胶的物理性能和生物性能，以期制备出一种可用于预防伤口感染，促进慢性伤口快速愈合的抗菌水凝胶敷料。

1 实验方法

1.1 实验试剂和仪器

聚乙烯醇-1799，成都市科隆化学品有限公司；聚苹果酸(50% in H2O)，上海麦克林生化科技有限公司；青霉素-链霉素溶液(双抗)、胰蛋白酶、DMEM高糖培养基，上海源培生物科技股份有限公司；MTT，北京酷来搏科技有限公司；胎牛血清，上海吉泰依科赛生物科技有限公司。

高压灭菌锅，上海博讯医疗器械有限公司；二氧化碳恒温培养箱，美国Thermo Scientific 公司；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；离心机，美国Scilogex公司；倒置生物显微(IX71)，日本Olympus公司；镜酶标仪(Multiskan GO)，美国 Thermo Scientific 公司；恒温磁力搅拌器，金坛市精达仪器制造有限公司；冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司；METTLER AE240电子天平，METTLER TOLEOD；扫描电子显微镜，日本Hitachi公司(S-4800型)；微机控制生物力学试验机，长春机械科学研究院有限公司(DNS20型)；傅立叶变换红外光谱仪，美国Perkin Elmer公司(Spectr μm 100)。

1.2 PMLA/PVA复合水凝胶的制备

准确称取适量的PVA放入纯水中，在70 ℃水浴加热下溶胀2 h，再以500 r/ min的转速，90 ℃下搅拌1 h形成均匀的10%PVA溶液。精确称取PLMA(50%inH2O)溶液，加入超纯水，搅拌均匀，制得10wt%PLMA溶液。将PLMA溶液与PVA溶液按一定质量比共混，混合溶液室温下以500 r/ min的转速搅拌30 min,再将混合溶液超声10 min,将混合均匀的溶液倒入培养皿中，在-20 ℃下冷冻20 h，拿出在室温下解冻4 h，冷冻-解冻循环3次，制得PMLA/PVA复合水凝胶。

1.3 PMLA/PVA复合水凝胶的性能评价

1.3.1 PMLA/PVA复合水凝胶的红外光谱检测

采用傅里叶变换红外光谱仪对待测干凝胶进行全反射测试。测试范围为4 000～500 cm-1，扫描次数为32，分辨率为1 cm-1。

1.3.2 凝胶分数

称取适量干凝胶M(g)，在50 ℃纯水中浸泡24 h滤去水凝胶中未交联的分子，剩余的凝胶在60 ℃下干燥，称重记为m(g)。每组3个平行样品，取平均值。凝胶分数用以下公式计算[14-15]：

(1)

1.3.3 溶胀率测定

将适量水凝胶冷冻干燥后称重记为m0，将干凝胶浸泡于超纯水中，一段时间t后拿出凝胶，用滤纸擦干凝胶表面水分后称其质量记为mt，每组3个平行样品，取平均值。按如下公式计算水凝胶t时刻的溶胀度SRt(%)：

(2)

1.3.4 保湿率测定

将水凝胶称重记为w0，于室温下静置一段时间t后称重记为wt，再将水凝胶烘干至恒重记为w3，每组3个平行样品，取平均值，水凝胶的t时保湿率SR(%)：

(3)

1.3.5 力学性能测定

参考国标GB/T1701—2001，将水凝胶剪成40 mm×10 mm的长条状，使用万能拉力机，在室温下以50 mm/min的拉伸速度进行试验，计算拉伸强度(σ)和断裂伸长率(ε)，计算公式分别如下：

(4)

式中：σ为拉伸强度， MPa；F为最大拉力，N；b为样条的宽度，mm；h为样条的厚度， mm。

(5)

式中：ε为断裂伸长率，%；L为样条拉伸后的长度， mm；L0为样品本身长度， mm。

1.3.6 扫描电子显微镜分析

PVA/PMLA复合水凝胶真空干燥后表面喷金，用扫描电镜在10 kV加速电压下观察其表面形态。

1.3.7 抑菌性能评价

采用抑菌圈法评价凝胶的抑菌性能，同时探究了PMLA含量对水凝胶抑菌性能的影响。分别取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(105～106CUF/mL)均匀涂布于营养琼脂平板培养基表面，将复合水凝胶(直径D=6 mm)凝胶片置于培养基上，37 ℃孵育12 h，观察薄片周围的细菌生长情况。

1.3.8 细胞毒性测定

参照GB/T16886.5—2003，取最佳配比的复合水凝胶，经紫外充分灭菌1 h后完全浸泡于完全培养基中，于37 ℃水浴中浸提24 h得到浸提液。

取培养到第三代的细胞，接种100 μL到96孔板中，每孔1 000个左右的细胞，细胞单层铺在孔底，加入100 μL水凝胶浸提液或新鲜培养基。设置空白、阳性对照组、阴性对照组和实验组，分组如下表1。再继续培养72 h天，每24 h取一个96板，每孔用20 μL MTT 溶液处理(5 mg/mL)，然后在37 ℃ CO2恒温培养箱中继续培养4 h。终止培养后，小心吸取孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO溶液，酶标仪测在490nm处测定并记录OD值，测定前先震板10 s。

表1 细胞毒性实验分组Table 1 Grouping of cytotoxicity experiments

细胞的毒性情况通过计算细胞相对增殖率(relative growth rate，RGR，%)来判定，计算：

(6)

材料毒性分级如下表2所示，材料毒性分级0或1级为合格，2级需结合细胞形态综合评价分析，3～5级为不合格[16-17]。

表2 材料毒性评分对照表Table 2 Comparison table of material toxicity scores

2 结果与讨论

2.1 红外光谱分析

PVA、PMLA和PVA/PMLA水凝胶的FT-IR谱图如图1所示。3 650～3 200 cm-1为O-H的伸缩吸收，O-H缔合和氢键形成均会会使吸收峰向低波数偏移，PMLA(3 237 cm-1)和PVA(3 246 cm-1)均有较强较宽吸收，而且峰型较宽，说明缔合程度较大。当两者混合后吸收峰发生左移(3 308 cm-1)，且峰宽变窄，说明缔合程度减少。1 850～1 630 cm-1为C=O的伸缩振动区，其中酮、酸的区域集中在1 725～1 700 cm-1，在PMLA的红外图谱中可以明显看到1 725 cm-1的吸收峰，当两者混合后吸收峰发生右移(1 714 cm-1)，当形成氢键时，吸收位置向低波数位移。COO-是一个多电子的共轭体系，两个C=O振动偶合，C-O在两个地方出现强吸收，分别是反对称伸缩振动在1 610～1 560 cm-1，对称伸缩振动在1 440～1 360 cm-1，PMLA的红外图谱中在1 591 cm-1和1 420 cm-1处有强吸收峰，当两者混合后1 591 cm-1的吸收峰几乎消失，COO-的反对称伸缩振动受到明显抑制，说明产生了氢键。实验结果表明PVA与PMLA混合后，两者形成了较强氢键作用。

图1 PVA、PMLA和PVA/PMLA水凝胶的FT-IR谱图Fig 1 FT-IR spectra of PVA, PMLA and PVA/PMLA hydrogels

2.2 凝胶分数

水凝胶是高分子交联而成的一种三维网状结构，凝胶分数表明了网络形成的程度以及网络在水中溶解的稳定性。不同质量比复合水凝胶的凝胶分数如图2所示，可以看出，复合水凝胶的凝胶分数在50%～82%之间，有着良好的稳定性。当PVA含量7%，PMLA含量0.25%时，复合水凝胶有着最高的凝胶分数(81.83±0.01%)；当PMLA含量一定时，凝胶分数随着PVA含量的增加而增加；但当PVA含量一定时，凝胶分数随着PMLA含量的增加而降低，这与冷冻解冻法制备PVA水凝胶的原理有关[18-20]，PMLA分子上含有大量游离的羧基(-COOH)，与PVA分子上的羟基(-OH)形成氢键，导致复合水凝胶的结晶度降低，凝胶分数减小。

图2 不同质量比复合水凝胶的凝胶分数Fig 2 Gel fraction of composite hydrogels with different mass ratios

2.3 溶胀率

水凝胶作为一种理想的创面敷料材料，其吸收和保存液体的能力是评价其效果的一个重要方面。水凝胶的溶胀率是评价凝胶吸收液体能力的重要指标。不同比例的复合水凝胶的溶胀性能如下图3所示。由图可知，PVA/PMLA复合水凝胶的溶胀率在500%～1 000%，具有良好的吸水性。溶胀12 h后，水凝胶的吸水速率变为缓慢，24 h后基本达到溶胀平衡状态。从图中可以看出敷料的溶胀率随着PVA浓度的增加而降低，在同一PVA浓度下随着PMLA浓度的增加而减少，这是因为PVA浓度增大复合水凝胶交联程度提高；在同一PVA浓度下，随着PMLA浓度的增大，PMLA和PVA有更多的氢键形成，交联度提高从而使溶胀率下降。当PVA为5%，PMLA为0%的水凝胶的溶胀率最高，可高达1 047%；溶胀率最低的是PVA为7%、PMLA为1%时的复合水凝胶，为548%。

图3 不同比例的复合水凝胶的溶胀时间曲线(图a为PVA5wt%，图b为PVA6wt%，图c为PVA7wt%)Fig 3 Swelling time curves for different ratios of composite hydrogels (Fig a for PVA 5 wt%, Fig b for PVA 6 wt% and Fig c for PVA 7 wt%)

2.4 保湿率

对于渗出伤口而言，敷料在吸收伤口渗液与蒸发的水分之间取得平衡是敷料应用的重要性能，保持伤口的湿润能为细胞再生和运动提供合适的条件，维持酶和表皮生长因子的生物活性，从而加速伤口愈[21]。图4显示了PVA/PMLA复合水凝胶的保湿能力与时间的关系。从图中可知，随着时间的增加，保湿率在逐渐下降。12 h后，复合水凝胶的保湿率在44%～70%，具有较好的保湿效果；24 h后，复合水凝胶的保湿率在6%～45%。从图4中还可明显地看出PVA水凝胶的保湿率明显低于PVA/PMLA复合水凝胶，随着PMLA浓度增加，保湿率增加。PVA为7%时，PMLA为1%的复合水凝胶的保湿能力最佳，保湿率为45.4%；PMLA为0%的水凝胶湿仅。这可能是因为聚苹果酸上具有很多游离的羧基可与水分子作用形成氢键，增强了水凝胶对水分子的吸附力，这有利于为皮肤提供一个湿润的环境。

图4 不同比例的复合水凝胶的保湿率-时间曲线(左图a PVA 7wt%,PMLA分别为0wt%、0.25wt%、0.5wt%和1.0%，图b为PMLA0wt%，PVA分别为5wt%、6wt%和7wt%)Fig 4 Humidity-time curves for different ratios of composite hydrogels (left panela PVA7 wt%, PMLA 0 wt%, 0.25 wt%, 0.5 wt% and 1.0 wt% respectively and panel b PMLA 0 wt%, PVA5 wt%, 6 wt% and 7 wt% respectively)

2.5 力学性能分析结果

不同配比的PVA/PMLA复合水凝胶通过万能力学试验机测得其拉伸力学性能如图5所示。从图中可以看出，PVA水凝胶的拉伸强度分别为0.025、0.038和0.048 MPa，裂伸长率在206.71%、182.23%、209.05%；PVA/PMLA复合水凝胶的拉伸强度在0.018～0.048 MPa，断裂伸长率在186.51%～235.32%之间。随着PVA的增加，拉伸强度增加显著，断裂伸长率没有显著变化；随着PMLA的增加，复合水凝胶的拉伸强度略有降低，断裂伸长率明显增大，说明在PVA/PMLA水凝胶中，PVA链对拉伸强度起主导作用，PMLA对拉伸强度影响较小，但可以增加复合胶的断裂伸长率，这是因为PMLA和PVA之间形成了氢键，使得PVA链的结晶度减低，拉伸强度降低；链段变长，同时PMLA作为非结晶链，增强了水凝胶的分子链长，其伸长能力有效地提高，断裂伸长率变化明显。

图5 复合水凝胶的力学性能(图a为断裂伸长率，图b为拉伸强度)Fig 5 Mechanical properties of the composite hydrogel (Fig a shows elongation at break, Fig b shows tensile strength)

2.6 扫描电子显微镜分析

由图6的电镜结果可以看出，PVA(5%)水凝胶和(5%/0.25%)合水凝胶具大量的三维网络结构。PVA水凝胶的孔隙率为69.6%，平均孔径397 μm；PVA/PMLA复合水凝胶的孔隙率为65.0%，平均孔径为515 μm，PVA/PMLA复合水凝胶的孔径明显大于PVA水凝胶，和红外吸收光谱分析的结果一致。即形成PVA/PMLA的复合水凝胶中，PVA分子间氢键结合减少，凝胶分率下降，PMLA和PVA之间形成了氢键，使得PVA分子间结合得更疏松，孔径增大。多孔的三维网络结构不仅有利于营养物质、氧气及水分在细胞之间进行传递，还有利于将细胞代谢的物质及时移除，从而促进细胞迁移增殖。

图6 水凝胶电镜图(A为PVA，B为PVA/PMLA)Fig 6 Hydrogel electron micrographs (A for PVA, B for PVA/PMLA)

2.7 抑菌实验

将不同配比的复合水凝胶对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄葡萄球菌(革兰氏阳性菌)进行抑菌实验，抑菌效果如图7所示。由图7可知，PVA水凝胶无抑菌性，PVA/PMLA复合水凝胶具有较好的抑菌性，PMLA的含量越高复合水凝胶的抑菌效果越好。当PMLA含量为1wt%时，复合水凝胶的抑菌效果较佳，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为14.8 mm和16.5 mm。

图7 不同配比复合水凝胶抑菌效果(图(a)为大肠杆菌，图(b)为金黄葡萄菌)Fig 7 Bacterial inhibition effect of different ratios of composite hydrogels (Fig (a) for E. coli, Fig (b) for S. aureus)

2.8 细胞毒性

以溶胀和保湿性能最佳的复合水凝胶制备浸提液，采用MTT法测得复合水凝胶3d的增殖情况与细胞毒性等级表3所示。由表3可知，实验组和对照组的1-3d的细胞相对增殖率都在80%～90%之间，细胞毒性等级都在1级，但复合水凝胶的相对增值率高于市售敷料，依据GB/T—16886.5—2003医疗器械生物学评价标准，浸提液对细胞均无显著影响。研究结果表明，复合水凝胶和市售敷料没有明显的细胞毒性，生物相容性优于市售敷料。