AMPK激活剂减轻重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺损伤

黄 伟，孔丽君，叶亚群，王宏伟

(温州医科大学附属第一医院 1.营养科；2. 浙江省胰腺肝脏危重病诊治新技术研究重点实验室；3.手术室，浙江 温州 325000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)的发病率为0.5‰～8‰，其中20%发展为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)[1-2]；SAP在发病早期就可以激活细胞因子级联反应信号通路，诱导炎性因子释放，炎性因子又与内毒素响应，导致患者产生全身性炎性和氧化应激反应，细胞能量供应严重不足，最终发展为多器官功能衰竭。因此，保证细胞能量供应能有效抑制炎性与氧化应激反应，是治疗SAP的重要突破口[3]。

磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)是三聚体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，被认为是调节细胞能量代谢的开关。激活的AMPK可减少ATP消耗和增加ATP产生，满足细胞能量需要以应对各种应激反应[4-6]。本文旨在探讨应用AMPK激活剂5-氨基-4-咪唑羧基酰胺核苷(5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside，AICAR)通过激活AMPK磷酸化，调节细胞能量代谢，抑制炎性反应和氧化应激反应，从而发挥保护SAP大鼠胰腺损伤的作用，为AMPK 激活剂应用于临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级雄性SD大鼠18只，体质量200～220 g，由温州医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(浙)2020-0001。动物饲养在温度24 ℃±1 ℃、相对湿度50%±1%、每天光照及黑暗时间各12 h的环境下，自由饮水，自由进食，两只分1笼饲养。所有动物研究(包括执行安乐死)均按照温州医科大学动物保健机构及根据国际实验动物饲养评估认证协会(AAALAC)和中国科学院生化与细胞所实验动物管理委员会(IACUC)指南进行。

1.1.2 试剂及试剂盒：抗AMPK和P-AMPK抗体(Cell Signaling Technology公司)；抗单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和髓过氧化物酶(MPO)抗体(Abcam公司)；AICAR(每瓶25 mg，Med Chem Express公司)；牛黄胆酸钠(Sigma-Aldrich公司)；超氧化物歧化酶(SOD)和胰腺组织丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物技术有限公司)；IL-6和TNF-α测定试剂盒(上海博蕴生物技术有限公司)；HE染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)。使用均按说明书操作。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将大鼠随机分为假手术组(NC组)、模型组(SAP组)和实验组(SAP+AICAR)组，造模前2 h给予AICAR 400 mg/kg干预)，用异氟烷麻醉(4%诱导，3%维持)后，5%牛黄胆酸钠按0.1 mL/kg泵入胆管造模；每组6只大鼠。造模24 h后各组大鼠均无死亡。用异氟烷麻醉大鼠，取腹主动脉血5～7 mL，并剪除心脏使大鼠安乐死；收集血清和胰腺组织用于后续检测。

1.2.2 蛋白质印迹：测定胰腺组织p-AMPK和AMPK表达水平[7]。

1.2.3 HE染色:将胰腺用4%甲醛固定，脱水，用石蜡包埋。胰腺用石蜡切片机制备厚度5 μm的组织切片，脱蜡，HE染色，光镜下观察胰腺病理损伤程度(改良Schmidt法对胰腺损伤的程度进行评分)和水肿程度。

1.2.4 免疫组织化学染色:胰腺组织切片经脱蜡，3% H2O2溶液处理10 min和山羊血清封闭30 min后，分别用稀释系数为1∶200的抗MCP-1和抗MPO抗体孵育过夜；经洗涤，再用山羊抗兔二抗对组织切片37 ℃孵育30 min洗涤后，加入DAB(diaminobenzidine)测定MCP-1表达量和MPO阳性细胞数量。

1.2.5 ELISA:测定大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、IL-6和TNF-α。

1.2.6 黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法:SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定，MDA采用硫代巴比妥酸法测定，检测均按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 AICAR显著激活SAP大鼠胰腺组织AMPK磷酸化

SAP组磷酸化AMPK水平较NC组明显降低(P<0.05)。实验组磷酸化AMPK水平较SAP组明显升高(P<0.01)(图1)。

2.2 AICAR减轻SAP大鼠胰腺组织损伤和胰腺水肿程度

SAP组胰腺腺泡细胞肿胀、分布紊乱、存在炎性细胞浸润；SAP+AICAR组胰腺腺泡细胞肿胀、分布紊乱、炎性细胞浸润情况较SAP组明显改善(图2A)。SAP组胰腺病理评分和胰腺水分含量均明显高于NC组(P<0.01)，实验组胰腺病理评分和水分含量均明显明显低于SAP组(P<0.01)(图2B，C)。

2.3 AICAR抑制SAP大鼠胰腺组织炎性细胞浸润

SAP组MCP-1蛋白表达量和MPO阳性细胞数量明显高于NC组(P<0.01)；实验组MCP-1蛋白表达量和MPO阳性细胞数量均明显低于SAP组(P<0.01)(图3)。

*P<0.05 compared with NC group； #P<0.01 compared with SAP group图1 胰腺组织中AMPK和p-AMPK的表达Fig 1 Expression of AMPK and p-AMPK in pancreatic

*P<0.01 compared with NC group；#P<0.01 compared with SAP group图2 AICAR减轻SAP大鼠胰腺组织损伤和胰腺水肿程度Fig 2 AICAR alleviated pancreatic tissue injury and pancreatic edema in SAP

2.4 AICAR减轻SAP大鼠胰腺损伤和抑制炎性因子释放

SAP组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、IL-6和TNF-α含量均明显高于NC组(P<0.01)；实验组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、IL-6和TNF-α含量均明显低于SAP组(P<0.01)(表1)。

表1 AICAR减轻SAP大鼠胰腺损伤并抑制炎性因子释放Table 1 AICAR alleviated pancreatic injury and inhibited the release of inflammatory factors in SAP

2.5 AICAR抑制SAP大鼠胰腺组织氧化应激反应

SAP组大鼠胰腺组织中MDA含量明显高于NC组(P<0.01),SOD活性明显低于NC组(P<0.01)；实验组胰腺组织中MDA含量明显低于SAP组(P<0.01)，而SOD活性明显高于SAP组(P<0.01)(图4)。

3 讨论

SAP是急性全身性消耗性疾病，主要表现为高分解代谢和低合成代谢状态，能量消耗相比静息状态显著增加[8]。

AICAR可激活AMPK磷酸化，调节细胞能量代谢，具有潜在的抗炎和抗细胞增殖活性功能[9]。本研究证明AICAR可激活AMPK磷酸化，使p-AMPK/AMPK比值明显升高，调节细胞能量代谢，从而抑制SAP大鼠胰腺腺泡细胞淀粉酶和脂肪酶的释放，减轻其胰腺病理损伤和水肿程度。

MCP-1可刺激大量自由基生成，导致巨噬细胞浸润，加重胰腺炎性反应[6,10]。MPO在氧化应激和不同的炎性反应刺激后过度表达，是巨噬细胞和中性粒细胞激活的标志[11]。此外，AICAR能够抑制TNF-α和IL-6等多种促炎因子释放，减轻组织器官损伤及炎性细胞浸润[6,12-13]。然而，AICAR是否能够抑制重症急性胰腺炎这种急性炎性反应，国内外还未见报道。有趣的是，本研究发现AICAR能明显降低SAP大鼠上调的TNF-α和IL-6等促炎因子的水平，表明AICAR可有效降低炎性反应，减轻SAP大鼠胰腺的炎性细胞浸润。

除上述炎性介质学说外，氧化应激反应在SAP的发生发展中也起着重要作用[13]。基于AICAR对SAP所致胰腺损伤的有效保护作用，据推测，AICAR可能作为一种外源性抗氧化剂对胰腺损伤具有保护作用。为了验证猜测，本研究检测了关键的内源性氧自由基MDA表达和抗氧化剂SOD的活性。结果表明，AICAR能有效降低SAP大鼠胰腺组织中上调的MDA水平并显著上调SOD活性，从而减轻氧化应激反应，恢复SAP大鼠胰腺的抗氧化能力，保护SAP大鼠胰腺免受损伤。

综上所述，在SAP大鼠模型中使用AMPK激活剂AICAR，可通过激活AMPK磷酸化显著抑制SAP大鼠胰腺组织的炎性反应和氧化应激水平，从而有效减轻SAP大鼠胰腺损伤，缓解胰腺水肿，有一定的临床应用前景和意义。

IOD.integrated optical density; HD.high powerlens; *P<0.01 compared with NC group；#P<0.01 compared with SAP group(scale bar=25 μm)

*P<0.01 compared with NC group；#P<0.01 compared with SAP group图4 AICAR抑制SAP大鼠胰腺组织氧化应激反应Fig 4 AICAR inhibited oxidative stress in the pancreatic tissue of SAP