羧基末端乙酰化修饰调控抑癌蛋白p53转录特异性

闫晓俊，徐文彬，王冬来

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学遗传学系，北京 100005)

p53 作为一种抑癌蛋白，参与细胞命运决定、DNA损伤应答和细胞代谢等生物学过程调控[1-2]。目前发现p53诱导的细胞周期阻滞、凋亡等功能的异常与肿瘤发生发展密切相关[3]，研究p53生物学功能的调控机制可为肿瘤靶向治疗和筛选抗癌药物提供依据[4]。蛋白质翻译后修饰(posttranslational modifications, PTMs)是 p53功能调控网络的重要环节[5-6]，其中乙酰化修饰不仅能够调控p53的总体转录活性及蛋白质的稳定性，还可以在特定条件下调控p53对某些类型靶基因转录的选择性[7]。研究发现羧基末端结构域(carboxyl-ter-minal domain, CTD)是乙酰化水平最高的区域[8]。通过构建模拟乙酰化p53(赖氨酸→谷氨酰胺；K→Q)的小鼠模型发现CTD乙酰化修饰参与p53总体转录活性的调控[9-10]。然而，在肿瘤细胞中，是否存在CTD乙酰化修饰特异性调控的p53下游靶基因，目前尚不清楚。本研究旨在通过构建模拟乙酰化p53的分子模型(图1)和稳转细胞株并结合全转录组测序(RNA-sequencing, RNA-seq)，研究肿瘤细胞中p53 CTD乙酰化修饰对基因转录特异性的调控。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人非小细胞肺癌细胞系H1299(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心/国家生物医学实验细胞资源库)。

1.1.2 试剂和试剂盒：无四环素的胎牛血清(Gibco公司)；DMEM培养基(Corning公司)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；载体测序(北 京 擎 科 生 物 科 技 有 限 公 司)；RNA测序(北京诺禾致源生物技术有限公司)；Doxycycline(Doxy)(Sigma-Aldrich公司)；嘌呤霉素、Trizol®和ECL(Invitrogen 公司)；SYBR(北京天根生化科技有限公司)。

TAD.transactive domain; PRD.proline-rich domain; DBD.DNA-binding domain; TD.tetramerization domain; A. schematic diagram of the functional domains of p53; B.structure of the lysine (K), acetylated lysine (Ac-K) or glutamine (Q)

1.2 方法

1.2.1 质粒的构建：克隆p53-WT和p53-6KQ全长cDNA，并与Flag标签融合；插入到改造后的pTripz载体的AgeⅠ和XholⅠ位点，构建成pTripz-F-hp53-WT和pTripz-F-hp53-6KQ质粒。pTripz-F-hp53-WT和pTripz-F-hp53-6KQ质粒的上游引物：5′-AATAC CGGTGCCATGGATTATAAGGATGATGACGATAAAG AGGAGCCGCAGTCAGATCCTA-3′，下游引物：5′-A TTCTCGAGTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCT-3′。经34个循环的变性、退火、延伸的PCR 反应得到扩增产物，并连接进经双酶切的pTripz载体中，在感受态大肠杆菌细胞中转化克隆，提取质粒并对扩增片段进行测序分析。

1.2.2 细胞的培养及分组处理：将H1299细胞置于含有10%无四环素胎牛血清DMEM的10-cm培养皿中，培养于37 ℃，5% CO2细胞孵箱中。贴壁细胞达到90%后，接种到3.5 cm培养皿中，24 h后换液。之后将构建的pTripz-F-hp53-WT和pTripz-F-hp53-6KQ质粒各2 μg转染到H1299细胞中，转染6 h后换液，待48 h后用含2 μg/mL的嘌呤霉素(puromycin)的DMEM培养基进行抗性筛选。将筛选后的H1299 pTripz-F-hp53-WT和H1299 pTripz-F-hp53-6KQ单克隆细胞分别分为实验组和对照组两组，实验组给予Doxy 1 μg/mL处理24 h，对照组不给予Doxy处理。

1.2.3 Western blot鉴定单克隆稳转细胞株：分别收集对照组和实验组的细胞至1.5 mL离心管，用NP40缓冲液提取蛋白。蛋白定量后，取适量蛋白95 ℃变性5 min。用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离后转入硝酸纤维素膜，封闭30 min后于4 ℃孵育一抗。用TBS-T缓冲液洗膜后室温孵育二抗1 h，TBS-T缓冲液清洗后用ECL孵育膜并曝光。

1.2.4 RNA-sequencing样品制备：分别用1 mL Trizol®试剂收集对照组和实验组的细胞至无RNase的1.5 mL离心管，在室温裂解后加入200 μL氯仿，快速混匀后于4 ℃离心。吸取400 μL上清液与400 μL的异丙醇混匀，在室温放置10 min 后于4 ℃离心。RNA沉淀加入75%的乙醇清洗，于4 ℃离心后去除上清，在室温静置干燥后加入适量DEPC(diethylpyrocarbonate)水溶解RNA沉淀。

1.3 统计学分析

将RNA样品进行全转录组测序，且用R语言(http://cran.r-project.org)的DESeq2、ggplot2、clusterProfiler软件包对基因表达谱数据进行差异表达分析、GO 富集分析和 KEGG 通路分析。其中筛选阈值为P<0.05, |log2 Fold Change|>1。

2 结果

2.1 构建可诱导表达p53的质粒和稳转细胞株

本研究将p53-WT或p53-6KQ的cDNA克隆到改造后的pTripz载体中(图2A)，测序结果表明成功构建了pTrip-F-hp53-WT和pTripz-F-hp53-6KQ质粒(图2B)。将pTrip-F-hp53-WT或pTripz-F-hp53-6KQ质粒转染到p53 表达缺失的H1299细胞中，并经过嘌呤霉素的筛选和克隆的分离，最终得到可诱导表达p53-WT或p53-6KQ的单克隆稳转细胞株(图2C)。在Doxy处理后，两株细胞内p53蛋白的表达均被显著诱导，且p53-6KQ的CTD乙酰化水平明显高于p53-WT，表明细胞模型构建成功(图2D)。

A. schematic diagram of a modified pTripz construct; B.sequencing results showing a substitution of the lysines with the glutamines in p53 CTD; C.workflow of generating a H1299 p53-inducible cell strain(p53 Ten-on); D.Western blot analysis of p53 and acetylated p53 in H1299 p53 Tet-on cell strain upon Doxy treatment

2.2 筛选CTD乙酰化修饰依赖的p53下游靶基因

对诱导表达p53-WT或p53-6KQ的H1299细胞进行全转录组测序并通过生物信息学分析进行筛选，在p53-WT组共筛选出2 439个Doxy处理前后差异表达的基因；在p53-6KQ组共筛选出1 473个Doxy处理前后差异表达的基因(图3A, B)。进一步分析发现在p53-WT组有1 403个基因上调，1 036个基因下调；在p53-6KQ组有870个基因上调，603个基因下调(图3C, D)。综合分析两组之间的差异表达基因后，筛选出1 167个受p53-WT和p53-6KQ共调控的基因、1 272个受p53-WT特异性调控的基因和306个受p53-6KQ特异性调控的基因(图3B)。

A.flow chart of sample preparation for RNA-sequencing; B，D.Venn diagram (B), heatmap (C) or volcano plots (D) showing differentially expressed genes regulated by p53-WT or p53-6KQ

2.3 CTD乙酰化依赖的p53下游靶基因的生物学功能分析

在GO富集分析中，306个p53-6KQ特异性调控的基因主要富集在细胞命运决定、基因转录调控、神经元发育、耳蜗发育、RNA聚合酶Ⅱ启动子区的转录、内膜细胞分化、细胞或亚细胞成分的运动、负性调控上皮细胞的分化等生物学过程(图4A)。在KEGG富集分析中，p53-6KQ特异性调控的基因主要富集在肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、黏着斑、加压素调节水的重吸收、百日咳、醛固酮合成和分泌、神经营养因子信号通路、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)-受体相互作用、蛋白质消化吸收、多巴胺能突触等信号通路(图4B)。

A.GO analysis of the top 10 biologcial processes specifically regulated by p53-6KQ; B.KEGG analysis of the top 10 pathways specifically regulated by p53-6KQ

3 讨论

本研究共筛选出p53 CTD乙酰化修饰特异性调控的基因306个，进行GO富集分析和KEGG富集分析发现这些基因参与多种生物学过程。富集的生物学通路中有一些与p53调控的细胞增殖、细胞凋亡和DNA损伤应答等生物学功能相关，包括：细胞命运决定基因PTCH2、GATA2、DLL1；正性调控转录的基因JUN、TFEB、MYB；肿瘤坏死因子信号通路基因MAPK10、JUNB、CREB5等。这些富集到的相关通路的基因生物学功能与文献报道相一致。例如：GATA2编码的GATA2作为一个转录因子，其参与早期造血细胞增殖和生存的生物学过程[11]，还有研究发现GATA2调控TP53表达从而调节肝癌细胞凋亡[12]。TFEB编码的TFEB蛋白是一个转录因子，在DNA损伤的情况下增强p53依赖的转录激活[13]。这些基因的发现表明p53 CTD乙酰化修饰具有增强p53抑癌功能的作用，也提示未乙酰化修饰的p53可能不足以激活某些具有抑癌功能的基因。因此，全面激活p53的肿瘤抑制功能，CTD乙酰化修饰是必不可少的。

此外，本研究还发现p53 CTD乙酰化修饰特异性调控参与神经元分化、耳蜗发育、内胚层细胞分化、垂体发育等生物学过程的基因表达，如神经元分化基因BARHL2、HDAC9；耳蜗发育基因RPGRIP1L、KCNK2；内胚层细胞分化基因COL11A1、LAMA3等。这一发现可归类于p53参与调控的“非经典(non-canonical)”生物学过程，表明CTD乙酰化修饰丰富了p53依赖的转录调控网络，为研究p53调控的生物学过程的内在联系提供新的思路。

本研究发现肿瘤细胞中p53 CTD乙酰化修饰通过特异性调控相关基因表达从而参与多种生物学过程，为探索p53乙酰化修饰的生物学功能提供新的方向。但p53 CTD乙酰化修饰是如何在这些生物学过程的调控中发挥作用及其与疾病的联系仍需进一步研究。