不同产地连翘中主要活性成分含量的比较

胡金婉，原江锋,2，王大红,2，李佩艳，龚明贵

(1.河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.东部战区总医院 药理科，江苏 南京 210002)

0 引言

连翘(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl)为木犀科连翘属落叶灌木，以野生为主。根据连翘果实成熟程度，商品中有青翘和老翘之分[1]。连翘在中国分布广泛，根据连翘资源的历史收购情况[2]，山西收购量约占总收购量的40%，河南约占30%，陕西约占20%，此外，湖北和安徽也是连翘资源的主产区。虽然同种药材的遗传特性具有相似性，然而由于地域和气候等自然条件的差异，其化学成分的含量会有差异。中药连翘因产地和采收时间的不同，其化学成分的含量也会有差异。《中国药典》以连翘苷和连翘酯苷A 的含量作为连翘质量控制指标[3]，但是连翘中还含有苯乙醇苷类、木脂素类、黄酮醇苷类和五环三萜类[4-5]等活性成分，连翘苷和连翘酯苷A 的含量并不能全面评价连翘的质量。因此，测定连翘中高丰度的代表性活性成分的含量来全面评价连翘质量具有重要意义。本试验收集了连翘主产区的5省13批连翘药材，采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法，对样品中的芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、齐墩果酸和熊果酸等5种活性成分进行了含量测定，并对测定结果进行主成分分析和聚类分析，比较不同产地青翘和老翘中5种活性成分的综合差异，旨在为连翘资源的综合利用提供一定的科学依据。

1 试验

1.1 仪器和试剂

仪器：1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；HZK2064B型鼓风干燥箱(重庆汉瞻仪器有限公司)；BS-124S 型万分之一天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-500DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DL-5-B型粉碎机(上海安亭科学仪器厂)。

试剂：甲醇、乙腈均为色谱纯(美国Fisher 化学试剂公司)；芦丁(批号100080-201408，质量分数>98.5%)、连翘酯苷A(批号111810-201304，质量分数>98.0%)、连翘苷(批号110821-201615，质量分数>98.5%)、齐墩果酸(批号110709-201206，质量分数>98.5%)和熊果酸(批号110742-201220，质量分数>98.5%)均购于中国食品药品检定研究院；其他试剂均为分析纯。

1.2 材料

13批连翘药材(编号为S1～S13)，2018 年收集于河南、山西、陕西、湖北和安徽，其中：S1和S3分别为河南卢氏和河南信阳青翘，S4、S5、S6、S7和S9分别为山西太原、山西长治、陕西太白、陕西洛南和陕西西安青翘，S10和S12分别为湖北武汉和安徽六安青翘，S2、S8、S11和S13分别为河南卢氏、陕西洛南、湖北武汉和安徽六安老翘。以上药材经河南科技大学农学院侯小改教授鉴定为木犀科植物连翘(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl)的干燥果实。试验材料在室温下避光存放于干燥器中，使用前用粉碎机粉碎。

1.3 测定条件

色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，芦丁、连翘酯苷A和连翘苷流动相Ⅰ为乙腈(A)-水(B，含有质量分数为0.2%的磷酸)，按照乙腈与水的体积比梯度洗脱，0～5 min，5%～15% A；5～10 min，15%～20% A；10～20 min，20%～22% A；20～35 min，22%～50% A；36～46 min，95% A。体积流量1.0 mL/min，检测波长275 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL；齐墩果酸和熊果酸流动相Ⅱ为V(甲醇)∶V(质量分数1%的磷酸)=85∶15，流速0.6 mL/min，检测波长210 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

1.4 混合对照品溶液的制备

精密称取芦丁、连翘酯苷A和连翘苷标准品，分别为10.0 mg、8.5 mg和9.5 mg，用甲醇溶解后定容于25 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得芦丁、连翘酯苷A和连翘苷质量浓度分别为0.40 mg/mL、0.34 mg/mL和0.38 mg/mL 的混合对照品溶液Ⅰ。精密称取齐墩果酸对照品13.5 mg，熊果酸对照品14.3 mg，用甲醇溶解后定容于25 mL容量瓶中，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，得到齐墩果酸和熊果酸质量浓度分别为0.54 mg/mL和0.57 mg/mL 的混合对照品溶液Ⅱ。

1.5 供试品溶液的制备

精密称取青翘和老翘(S1～S13)粉末(过40目筛)2.00 g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入70%(体积分数，下同)甲醇50 mL，密塞，称量质量，浸渍3 h，超声(250 W，40 kHz)处理30 min，放冷，再称量，用70%甲醇补足损失质量，摇匀，过滤，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。样品平行处理3次。

2 结果分析

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液Ⅰ 0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL和8.00 mL，用甲醇分别定容于10 mL容量瓶中；分别精密吸取混合对照品溶液Ⅱ 0.20 mL、0.40 mL、0.80mL、1.60 mL、3.20 mL和5.00 mL，用甲醇分别定容于10 mL容量瓶中。按1.3小节的色谱测定条件检测，以对照品的峰面积为纵坐标(Y)，进样质量浓度为横坐标(X)，得到线性回归方程及线性范围，见表1。

表1 线性回归方程及线性范围

2.1.2 精密度试验

取编号为S3样品粉末1份，按1.5小节的步骤制备供试品溶液，按1.3小节的色谱测定条件连续进样6次，记录峰面积，计算相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)。经计算，5种活性成分峰面积的RSD为1.52%～1.89%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性试验

取编号为S2样品粉末1 份，按1.5小节的步骤制备供试品溶液，按1.3小节的色谱测定条件，分别在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h进行检测，记录峰面积，计算RSD。经计算，5种活性成分峰面积的RSD为1.37%～1.98%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.1.4 重复性试验

取编号为S3粉末6份，按1.5小节的步骤制备供试品溶液，按1.3小节的色谱测定条件进样， 记录峰面积，并计算RSD。经计算，5种活性成分峰面积的RSD为1.24%～1.86%，表明此方法重复性良好。

2.1.5 回收率试验

精密称定已知含量的同一连翘样品1.00 g，平行6份，分别加入一定量的对照品溶液，制备供试品溶液，按1.3小节的色谱测定条件，计算回收率和RSD。经计算，5种活性成分的回收率为97.6%～102.3%，RSD为1.15%～1.84%，表明所建立的方法准确度良好。

2.2 HPLC 图谱分析

称取连翘(S1～S13)粉末，按照1.5小节的方法制备供试品溶液，在1.3小节的色谱测定条件下进样，记录5种活性成分的保留时间和峰面积，用外标法分别计算芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、齐墩果酸和熊果酸的含量。

13批不同产地连翘样品的HPLC图见图1。混合流动相Ⅰ的连翘样品色谱图见图1a，混合流动相Ⅱ的连翘样品色谱图见图1b。由图1可知：指标成分与其他成分的色谱峰分离良好，且与对照品保留时间一致。13批不同产地连翘中5种活性成分含量测定结果见表2。由表2可知：连翘中连翘酯苷A含量为2.77～48.20 mg/g，连翘苷含量为0.81～5.12 mg/g。《中国药典》以连翘酯苷A 和连翘苷的含量作为连翘质量控制指标[3]，规定连翘药材中连翘酯苷A 的含量不得低于2.50 mg/g，连翘苷含量不得低于1.50 mg/g，河南卢氏老翘(S2)中连翘苷的含量仅为0.81 mg/g，低于此质量控制标准，也有文献报道过河南卢氏老翘中连翘苷含量较低[6]，因此建议卢氏地区的连翘使用青翘入药为宜。其余12批连翘中连翘苷和连翘酯苷A的含量均高于《中国药典》规定的限量标准，这些地区的青翘和老翘均可入药。芦丁具有抗自由基、保护胃肠道黏膜等生物活性[7]；齐墩果酸具有抗病毒、消炎等功效[8-9]；熊果酸在保肝、降血糖等方面作用显著[10-11]。由表2可知：连翘中芦丁含量为1.47～5.74 mg/g，齐墩果酸含量为2.00～10.41 mg/g，熊果酸含量为2.96～14.50 mg/g，说明连翘除了具有连翘酯苷A和连翘苷的抗氧化、抑菌等生理活性外[12-13]，还具有芦丁、齐墩果酸和熊果酸化合物的生理活性。

本试验检测的13批不同产地连翘中连翘酯苷A的含量明显高于连翘苷，文献[14]也发现连翘提取物中活性成分以连翘酯苷A为主。同一产地青翘中芦丁、连翘酯苷A和连翘苷的含量基本均高于老翘，这与文献[15-16]所报道的结果趋势相同。安徽六安青翘中齐墩果酸和熊果酸的含量高于老翘，但湖北武汉老翘中这两种成分的含量高于青翘，说明齐墩果酸和熊果酸在青翘、老翘中的含量高低趋势不固定。

(a) 流动相Ⅰ的样品色谱图

(b) 流动相Ⅱ的样品色谱图

图1 不同产地连翘样品的HPLC 图

2.3 主成分分析

表3 成分矩阵

应用SPSS 25.0软件，对13批不同产地连翘中5种活性成分的HPLC含量测定结果进行主成分分析。以初始特征值大于1为提取标准，总方差解释结果显示主成分1(principal component 1, PC1)和主成分2(principal component 2, PC2)的累积贡献率达到80.68%，表明前两个主成分代表了样品组分的大部分信息，可用这两个主成分对连翘药材进行综合评价，成分矩阵结果见表3。由表3可知：对PC1贡献较大的是芦丁、连翘酯苷A和连翘苷，对PC2贡献较大的是齐墩果酸和熊果酸。根据两个主成分(PC1、PC2)得分，以各主成分的方差贡献率作为权重，进行线性加权，构建连翘质量评价函数，得出不同产地连翘的综合得分值，见表4，分值越高表示品质相对越好[17]。由表4可知：河南信阳青翘(S3)和安徽六安青翘(S12)的综合评价较好，而河南卢氏老翘(S2)的综合评价相对较差。

表4 不同产地连翘的综合得分值

2.4 聚类分析

聚类分析是将相似度大的样品优先聚合，最终按照类别的综合性质完成多个品种聚合的过程[18]。为了考察连翘中5种活性成分含量差异与产地、青老翘采摘时间之间的相互关系，以13批不同产地连翘中5种活性成分的含量为基准进行聚类分析，采用离差平方和法，以平方欧氏距离作为样品相似性的

图2 13批连翘样品聚类分析图

测度[19]，分析结果见图2。选择阈值为25，则13批不同产地连翘样品可分为4个大类：第1类，河南卢氏青翘(S1)、陕西太白青翘(S6)、陕西洛南青翘(S7)、陕西西安青翘(S9)，这4个批次连翘中芦丁、连翘酯苷A和连翘苷含量相当，聚为一类；第2类，河南卢氏老翘(S2)、陕西洛南老翘(S8)、湖北武汉青翘(S10)、湖北武汉老翘(S11)，这4个批次连翘中熊果酸含量较高，聚为一类；第3类，河南信阳青翘(S3)、安徽六安青翘(S12)，这2个批次连翘中芦丁、连翘酯苷A和连翘苷的含量较高，聚为一类；第4类，山西太原青翘(S4)、山西长治青翘(S5)、安徽六安老翘(S13)，这3个批次连翘中齐墩果酸和熊果酸含量接近，聚为一类。第3类中S3、S12聚成一类，这两个样品在主成分分析中综合得分排序分别为第1位和第2位，表明聚类结果与主成分分析结果一致。聚类结果也发现，除安徽六安老翘(S13)外，基本按地域性聚成4类，S1、S6、S7和S9属于同一造山系的秦岭山脉和伏牛山脉的青翘聚成一类，熊果酸含量较高的湖北武汉、陕西洛南和河南卢氏的老翘聚成一类，河南信阳和安徽六安同属于大别山脉的青翘聚为一类，而山西太原和山西长治的青翘聚成一类，该分类符合地域分布特征。除了湖北武汉青翘和安徽六安老翘，聚类分析能够区分样品中的青翘和老翘。

3 结论

(1)建立了不同产地连翘的HPLC指纹图谱，在色谱条件下测定结果显示5种活性成分的线性关系良好(r=0.999 3～0.999 7)；稳定性和重复性的RSD均小于2%；回收率为97.6%～102.3%，RSD为1.15%～1.84%。

(2)河南信阳青翘中的芦丁、连翘酯苷A 和连翘苷的含量均为最高，同一产地青翘中这3 种活性成分的含量高于老翘，从活性成分的含量来看，建议采摘青翘入药。

(3)主成分分析以5 种主要活性成分含量为基础构建了连翘的质量评价函数，能够直观评价不同产地连翘药材的差异性，综合质量评价排序结果显示河南信阳青翘排在第1位，安徽六安青翘排在第2位，表明这两个产地青翘的综合质量评价相对较好。

(4)聚类分析将13批不同产地连翘分为4大类，主要是根据连翘的产地和青老翘采摘时间进行分类。除了安徽六安老翘，同属于秦岭和伏牛山脉的河南和陕西主产区的青翘和老翘各聚为一类，同属于大别山脉的河南信阳和安徽六安的青翘聚为一类，而山西太原和山西长治的青翘聚成一类。聚类分析结果对于连翘资源的综合利用具有一定的指导意义。