基于多壁碳/金纳米管制备电极测定烟草中14-3-3蛋白与蛋白印迹的方法比较

杨康兵，赵树鑫，李方慧，陈丽梅，李昆志

(昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500)

0 引 言

14-3-3蛋白是烟草细胞中一组高度保守的酸性二聚体蛋白质，调节着许多重要细胞生命活动，如新陈代谢、细胞生长发育、细胞的存活和凋亡以及基因转录[1].很多研究发现14-3-3基因的转录、翻译及其与靶蛋白的相互作用可对非生物胁迫产生应答[2-3].14-3-3蛋白对烟草中的碳和氮代谢有广泛的调控作用[4-5]，14-3-3蛋白通过与碳代谢途径关键酶如蔗糖磷酸合酶[6]、脂肪氧化酶[7]互作影响这些酶的活性，从而影响光合产物的形成.因此，14-3-3蛋白已成为研究烟草组织代谢的重要靶点[8].如何灵敏、快捷地检测烟草14-3-3蛋白具有非常重要的意义.

目前,蛋白印迹分析(Western Blot，WB)手段被广泛用于检测烟草14-3-3蛋白[9-11]，但是WB操作较为繁琐、时间过长、灵敏度低而达不到理想效果[12].近年来，基于纳米金材料具有导电性好、催化活性高和高电子密度特性等优势，开发出辣根过氧化物酶等一些抗体酶偶联纳米金作为电化学传感器的信号探针，纳米修饰材料在电化学领域中得到广泛应用[13-14].同时，电化学传感器在生物蛋白检测结果中显示出更高的灵敏度和检测效率，在检测生物蛋白等标志物中已得到应用[15].

本研究将多壁碳/金纳米管(WCNTs/AuNs)修饰丝网印刷工作电极表面，然后将14-3-3抗体结合到多壁碳/金纳米管上，再加入检测14-3-3蛋白，最后加入纳米信号探针(Anti-14-3-3-Au-CAT)形成夹心免疫传感器.信号探针上的过氧化氢酶CAT催化底物 H2O2形成电化学信号而被电化学分析工作站检测.通过测定已知不同浓度的烟草14-3-3蛋白对应不同稳态电流信号峰值的显著线性关系，实现免疫传感器检测烟草14-3-3蛋白.与常规蛋白印迹分析比较，该传感器检测烟草14-3-3蛋白具有灵敏度高、简便快捷、低耗资源等优良性能，这极大地节省资源，加快研究进展.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

CHI-660B 电化学分析工作站(上海辰华仪器公司)；碳基丝网印刷电极(工作电极为碳，对电极为碳，参比电极为银/氯化银，6mm型号：B1008156); H-7650型透射电镜(日本日立公司)；TU-1901 型双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器公司); Medium EDI超纯水仪(上海和泰仪器公司).质量分数为1%氯金酸,质量分数为1%柠檬酸三钠,质量分数为1%鞣酸, 质量分数为1%牛血清白蛋白(BSA)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐(EDC)，巯基乙酸，聚酰胺-胺(PAMAM), N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)均购自国药集团化学试剂有限公司；电极洗液为pH 7.2的磷酸盐缓冲液，含0.1 mmol/L NaCl和质量百分比浓度为1%的Tween 20.多壁碳纳米管(WCNTs，直径<8 nm，深圳纳米技术有限公司).实验不同pH的PBS溶液为磷酸盐缓冲溶液.

本研究根据大豆过氧化氢催化酶(Glycine max catalase，GmCAT，NM_001253092.1) 序列用Premier 5.0软件设计特异引物，引物由擎科生物公司合成，从丹波黑大豆中的cDNA扩增出GmCAT的全长序列，构建其原核表达载体，并在大肠杆菌中表达纯化获得CAT蛋白.用同样的方法获得烟草Nt14-3-3蛋白(NW_015817570.1)[16-17].14-3-3蛋白抗体免疫兔获得.

1.2 SPCE│WCNTs-Au-anti-14-3-3-14-3-3p-{Anti-14-3-3-Au-CAT} 电流型免疫传感器的制备

首先，制备WCNTs-Au纳米复合物: 2 mL胶体金溶液加入到2 mL PAMAM (0.07 mmol/L) 与1 mmol /L甲酸等体积各2 mL混合液里，同时迅速搅拌，直到溶液由黄色变为红色为止[18].将WCNTs在HNO3/ H2SO4(1∶3 V / V)溶液中回流5h以羧化.将产物过滤并洗涤至中性，然后将WCNTs在真空下干燥过夜.再将1.0 mg WCNTs分散在4 mL去离子水中，加入1.0 mL EDC / NHS溶液(2 mM∶5 mM)并在室温下通过磁力搅拌2 h以活化WCNTs表面的羧基团.离心洗涤后，将获得的沉淀物分散在5.0 mL PBS中，并逐滴添加6 mL上述PAMAM-Au纳米复合材料.缓慢搅拌6h，离心并用净水洗涤3次，最后分散在0.5 mL去离子水中，制得纳米复合物WCNTs-Au.

其次，制备金纳米信号探针.按照文献[19-20]制备胶体金液: 将质量分数为1%氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1%柠檬酸三钠，质量分数为1%鞣酸，25 mmol/L K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.05∶0.05∶15.9配成B液；再将B液水浴内加热到59～61℃；用磁力搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1min，在10～13min内加热至沸腾，冷却后得到胶体纳米金(AuNs)溶液.取5 mL胶体纳米金溶液，先用K2CO3溶液调节胶体金溶液pH至9，然后加入100 μL EDC (4.2 μg/μL), 40 μL14-3-3抗体 (200 μg/mL)和100 μL CAT(6 μg/μL), 在室温下缓慢搅拌2 h.用100 μL BSA (1%)封闭30min，将上述溶液在15000 r/min转速下离心15min,弃去上清液, 下层悬浮液经pH7.4 PBS离心分离、洗涤后，得到金纳米信号探针复合物{Anti-14-3-3-Au-CAT}.

最后，制备电流型免疫传感器.将10 μL WCNTs-Au溶液均匀滴到工作电极上.室温干燥后将工作电极浸入到25 mmol /L的巯基乙酸的乙醇溶液(TGA)中,在4 ℃下过夜保存后，依次用乙醇和电极洗液清洗电极，氮气风干待用.再将10 μL EDC/NHS(2 mmol /L∶5mmol /L)滴涂到工作电极，保持30min以活化电极表面的羧基,电极用洗液洗涤3次.再将5 μL捕获抗体{Anti-14-3-3}滴到电极上，温育30min.制备的SPCE│WCNTs-Au-Anti-14-3-3电极用1.0% BSA封闭20min, 除去非特异性吸附位点.将5 μL不同浓度的目标14-3-3蛋白滴于电极表面，温育30min.然后加5 μL的{Anti-14-3-3-Au-CAT}纳米信号探针复合物并温育30 min，电极洗液清洗后即制得电化学免疫传感器(SPCE│WCNTs-Au-Anti-14-3-3-14-3-3p-{Anti-14-3-3-Au-CAT}).纳米金(AuNs)粒子和WCNTs均可提高电极的导电性，并扩增催化电流，由此提高了14-3-3蛋白检测灵敏度，传感器工作电极的构造和修饰如图1所示.

图1 传感器的工作电极构造和修饰Fig.1 Construction and modification of the working electrode of the sensor

1.3 电流型免疫传感器检测方法

采用传统的三电极体系(免疫传感器为工作碳电极，对电极为碳，参比电极为银/氯化银)，在电化学工作站上以示差脉冲伏安法( Different Pulse Voltam-metry，DPV)进行电化学检测.以含40 mmol /L H2O2的PBS(pH 7.0)作为测试底液，通过DPV法(扫描速度:100mV/s,电压:-0.6～0.2 V)扫描时间为50s，此时电流信号已经趋于稳定)检测传感器的电化学特性.基于DPV法，其中脉冲振幅为50 mV.最后，测定14-3-3蛋白浓度与响应信号电流间的关系.制作信号电流值对应14-3-3蛋白浓度线性关系标准曲线，同时考察烟草14-3-3蛋白检测浓度与稳态信号电流值之间的线性关系及其相关系数的显著水准；将测得样品电流信号值代入该线性关系标准曲线中可得出样品烟草14-3-3蛋白浓度；再根据呈现的线性关系结果考察14-3-3蛋白检测传感器的稳定性和精准度.

2 结果与讨论

2.1 纳米信号探针的表征

通过透射电镜与粒径分析仪分析，观察到胶体纳米金颗粒粒径为55～65 nm，平均粒径为60 nm(TEM，图2a)，金纳米信号探针复合物粒径增加到100～120 nm(图2b).金纳米信号探针复合物粒子的直径较纳米金(AuNs)明显增大，原因是大分子蛋白包覆在AuNs粒子的表面，导致其粒径增加近一倍，表明金纳米信号探针自身有突出显著的稳定结构.

2.2 纳米信号探针复合物的紫外可见吸收光谱表征

纳米金及纳米探针复合物的紫外可见吸收光谱图如图3.图3(a)表明单纯的AuNs在200～600 nm波长范围没有出现吸收峰，而图3(b)表明{Anti-14-3-3-Au-CAT}在280 nm、470 nm两处出现两个特征吸收峰，其中280 nm是14-3-3抗体蛋白质的特征吸收峰，470 nm是CAT酶的特征吸收峰，说明Anti-14-3-3和CAT已成功地固定在纳米Au粒子表面，形成了{Anti-14-3-3-Au-CAT}纳米探针复合物.280nm和470 nm处两个特征峰说明{Anti-14-3-3-Au-CAT}复合物具有与众不同的特征.

(a) AuNs的透射图； (b)金纳米信号探针复合物透射图图2 纳米金与金纳米信号探针复合物的透射电镜图Fig. 2 Transmission electron microscopy (TEM) of Au nanoparticles (AuNs) and singal nanoprobe {Anti-14-3-3-Au-CAT}： (a)TEM image of AuNs; (b) TEM image of {Anti-14-3-3-Au-CAT}

a.AuNs的紫外-可见吸收光谱；b.金纳米信号探针的紫外-可见吸收光谱图3 纳米金粒子和金纳米信号探针复合物的紫外-可见吸收光谱Fig.3 UV-vis spectra of Au (AuNs ) and nanoprobe complex{Anti-14-3-3-Au-CAT}：a. UV-vis spectra of AuNs; b. UV-vis spectra of {Anti-14-3-3-Au-CAT}

2.3 免疫传感器的电化学表征

利用交流阻抗法(EIS)进行电极修饰过程的表征.不同被修饰的电极在含5 mmol /L Fe(CN)64-/3-和0.5 mol /L KCl的PBS溶液中的交流阻抗图，如图4.不同修饰的电极阻抗也对应各自的相应变化.同WCNTs的阻抗图(曲线a)进行比较，纳米Au粒子嵌入WCNTs纳米管后，相应的阻抗值显著减小，说明纳米Au粒子的嵌入加速了电子传递速率(曲线b)，也表明纳米Au粒子成功嵌入到WCNTs纳米管中.在单抗(Anti-14-3-3)固定到电极上后，导致其阻抗值进一步增加(曲线c)，原因是抗体作为非导电性物质，会阻碍电子的传递.同时，随着目标蛋白14-3-3与{Anti14-3-3-Au-CAT}金纳米信号探针复合物依次结合到电极表面，阻抗值依次增大(曲线d和e).阻值的显著增加，表明金纳米探针复合物能迅速紧密捕获到工作电极上.

(A) 不同修饰电极的交流阻抗图 (B) 循环伏安图a. SPCE│WCNTs；b.SPCE│WCNTs-Au；c.SPCE│WCNTs-Au-Anti-14-3-3；d.SPCE│WCNTs-Au-Anti-14-3-3-14-3-3p；e.SPCE│WCNTs-Au-Anti-14-3-3-14-3-3p-{Anti-14-3-3-Au-CAT}图4 不同修饰电极的交流阻抗图和循环伏安图Fig. 4 AC impedance diagram and cyclic voltammogram of different modified electrodes

(a) pH 值与催化电流关系 (b) 结合时间与催化电流关系 (c) 结合温度与催化电流关系 图5 免疫反应pH 值、结合时间、结合温度对电化学免疫传感器测定的影响Fig. 5 The effect of pH, binding time and binding temperature on electrochemical immunosensor

2.4 反应条件的优化

2.4.1 免疫结合反应温度、结合时间及pH值的选择

免疫反应受温度、结合时间及pH值的影响.强酸或强碱性环境、高温都会破坏蛋白质结构，同时降低蛋白质活性.在固定烟草14-3-3蛋白浓度为0.5 μg/mL 条件下，在pH 7.0时检测电流峰值最大(图5a)；在反应结合时间为30 min时，电流峰值不再增大(图5b)；而当反应结合温度控制在35℃时，免疫反应完全(图5c).因此，本研究优化的最佳条件为pH 7.0，免疫结合时间为30 min，结合温度为35℃.

2.4.2 金纳米信号探针催化过氧化氢反应条件的优化

金纳米信号探针{Anti-14-3-3-Au-CAT}、底物过氧化氢用量及其被催化时间都突显出传感器免疫反应发生的程度，并最终影响传感器检测的电流峰值.基于浓度为0.5 μg/mL烟草14-3-3蛋白来考察优化条件.记录金纳米信号{Anti-14-3-3-Au-CAT}和过氧化氢的浓度，以及酶底物反应时间对催化电流的影响.结果表明：当加入{Anti-14-3-3-Au-CAT}浓度达到5 μg/mL(图6 a)，过氧化氢量为40.0 mmol/L(图6 b)，以及{Anti-14-3-3-Au-CAT}探针催化过氧化氢反应50s后(图6 c)，测定催化反应相应的电流峰值已经达到最大值，之后趋于稳定保持.因而，适宜条件选择加入金纳米信号探针{Anti-14-3-3-Au-CAT}(Acasp)浓度为5 μg/mL，底物过氧化氢浓度为40.0 mmol/L，反应时间为50s.

(a)金纳米探针浓度对催化电流的关系 (b)底物过氧化氢浓度与催化电流的关系 (c)反应时间与催化电流的关系 图6 探针{Anti-14-3-3-Au-CAT}浓度、过氧化氢底物浓度和催化反应时间对催化电流的影响Fig. 6 Effects of {anti-14-3-3-Au-cat} probe concentration, hydrogen peroxide substrate concentration and catalytic reaction time on catalytic current

2.5 免疫传感器对烟草14-3-3蛋白的电化学检测

2.5.1 烟草14-3-3蛋白原核表达纯化

用本实验室构建好的烟草14-3-3基因原核表达载体进行蛋白表达纯化获得烟草14-3-3 蛋白.用Bradford 法[21]检测纯化的烟草14-3-3蛋白浓度为2.5 μg/mL，然后依次a-f稀释烟草14-3-3蛋白浓度为0.02、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL，再进行SDS-PAGE凝胶成像(图7A)和-免疫印迹成像(图7B).结果表明：在35.0～45.0 kD之间得到一条烟草14-3-3蛋白特征带，没有其他杂带，说明烟草14-3-3蛋白纯度较高，并且随着14-3-3蛋白上样量从a到f浓度的逐渐增加，条带的清晰度也越来越高(图7A).Western Blot分析结果也表明随着蛋白上样量从a到f浓度的逐渐增加，条带的清晰度也逐渐增加(图7B).这些结果说明原核表达纯化获得的烟草14-3-3蛋白纯度较高，可用于14-3-3蛋白浓度检测标准曲线制作.

a～f依次为纯化烟草14-3-3蛋白浓度: 0.02、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL(A)纯化烟草14-3-3 蛋白浓度梯度电泳; (B) Western Blot 分析图7 纯化烟草14-3-3 蛋白浓度梯度电泳与Western Blot 分析Fig.7 Concentration gradient electrophoresis and Western Blot analysis of pure 14-3-3 protein

2.5.2 烟草14-3-3蛋白的电化学检测

配制纯化烟草14-3-3蛋白浓度分别为0.01、0.02、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 μg/mL样品，在优化条件下，在免疫传感器修饰的工作电极上先加入样品5 μL，然后加5 μL浓度为40.0 mmol/L过氧化氢溶液，发生催化反应并通过DPV法扫描，获得烟草14-3-3蛋白测定曲线.结果表明:随着烟草14-3-3蛋白浓度的增加，免疫传感器测得的电流响应值不断增大.由于竞争性免疫反应，测试样品中游离烟草14-3-3蛋白和工作电极上的14-3-3抗体发生免疫结合反应，然后再与金纳米信号探针的抗体结合，样品烟草14-3-3蛋白浓度越高，结合纳米探针的量就越大，催化H2O2反应就越快，测得的电流值就越大.由各浓度的14-3-3蛋白样被测定的电流信号峰值为纵坐标，同时以14-3-3蛋白标准样各浓度值为横坐标作图8A，该图呈现“s”形状图，在高浓度和低浓度范围，斜率降低，趋于平直，中间浓度线性相关性较显著(图8B).由该方法获得的检测适宜浓度范围为0.01～0.5 μg/mL，检测下限为0.01 μg/mL，同时统计得到各种浓度的烟草14-3-3蛋白检测误差均小于5%，而传统Western Blot 方法检测下限为0.2 μg/mL，这比传统Western Blot检测方法低1个数量级[22-24].

(A)14-3-3蛋白浓度与信号电流峰值关系;(B)14-3-3蛋白浓度与反应信号电流峰值线性关系图8 免疫传感器测定14-3-3蛋白浓度与反应信号电流峰值的曲线关系Fig. 8 Curve relationship between 14-3-3 protein concentration and peak value of response signal current measured by immunosensor

2.6 免疫传感器实际检测结果及检测精度的储存稳定性

根据本研究优化的条件，用0.05、0.1、0.5 μg/mL的纯化14-3-3蛋白样各5个来检测电流型免疫传感器的工作电极SPCE│WCNTs-Au-Anti-14-3-3和金纳米信号探针复合物{Anti-14-3-3-Au-CAT}的储存稳定性.将传感器、工作电极和金纳米信号探针复合物在密闭冰箱4 ℃下储存一个月后检测，对比前后相对标准偏差(RSD)和检测电流信号的灵敏度(见图9)，结果表明储存一个月后的传感器检测相对标准偏差RSD<0.5%，检测电流信号峰值下降范围△Imax<5%，表明该传感器不仅在检测上有良好的精密度，在存储上也有较好的稳定性.

图9 新制免疫传感器与4 ℃下放置储存一个月免疫传感器检测烟草14-3-3蛋白结果比较Fig.9 Comparison of tobacco14-3-3 protein detection results between the new immunosensor and the immunosensor s6tored at 4 ℃ for one month

2.7 烟叶14-3-3蛋白传感器和Western Blot检测比较

提取野生wt、过量表达烟草kc1和kc3、抑制表达烟草rc3和rc4烟草叶总蛋白，用本研究制备的免疫传感器和Western Blot检测烟草叶中14-3-3蛋白含量，每个样品各测5次，测定结果见表1.结果表明免疫传感器测定14-3-3蛋白浓度与常规Western Blot检测结果较一致，说明该传感器检测烟草14-3-3蛋白不受烟叶中其他蛋白含量以及其他杂质的影响，具有可靠的稳定准确度.

表1 14-3-3蛋白电化学传感器检测与Western Blot检测结果比较

3 结 论

已有研究表明纳米金修饰的电极传感器比传统常规Western Blot等技术检测效果更好.本研究基于多壁碳/金纳米管(WCNTs/ AuNs)复合新材料修饰丝网印刷工作电极表面制备双单抗体电化学免疫传感器对烟草14-3-3蛋白进行检测.研究结果表明：本免疫传感器可高灵敏地检测烟草14-3-3蛋白含量，蛋白浓度检测线性范围为0.01～0.5 μg/mL；结合本研究每个电极片加5 μL的蛋白检测样，可知本研究蛋白质量检测范围为0.05～2.5 ng.而传统Western Blot 方法检测下限为0.2 μg/mL，且分析时影响因素众多，常出现操作耗时复杂、非特异条带多、拖尾等问题.相比之下，本方法对烟草14-3-3蛋白含量的检测限低，稳定灵敏，成本低，方便快捷，这提高了对烟草14-3-3蛋白的检测效率，在检测烟草14-3-3蛋白上具有推广应用价值，节省资源，加快研究进展.